摘要：目的研究高温灭菌对黄芪有效成分含量的影响，考察灵芝在含黄芪基质的生长情况。方法紫外分光光度法测定黄芪多糖、总黄酮和总皂苷的含量。结果高温处理后测得多糖和黄酮含量分别增大了56.3％和43.8％，黄芪皂苷含量降低了63.2％。黄芪固态发酵前10 d 菌质多糖含量变化剧烈，30 d 后多糖含量基本不变，从而确定为发酵终点。结论高温灭菌对黄芪有效成分含量有一定影响，灵芝在含黄芪基质长势良好。
关键词：高温灭菌；黄芪；固态发酵；多糖
中图分类号：R927.7文献表识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0008-03
Changes of Effective Components of Radix Astragali by Solid Fermentation
YU Shuai-Lu , HE Xun , LU Li-Xia , XIONG Xiao-Hui
(Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China)
Abstract：Objective To study the effect of sterilizing at high temperature on the content of effective components in Radix Astragali and the growth of Ganoderma lucidum in medium containing Radix Astragali. Methods The contents of polysaccharides, total flavonoids and saponins were determined by UV-spectrophotometry. ResultsThe contents of polysaccharides and flavonoids increased by 56.3% and 43.8% respectively, and the content of saponins decreased by 63.2% after high temperature processing. During the first ten days, the content of fungus polysaccharides changed violently. But the content change was very small after thirty days, thus, the end point of fermentation was determined. Conclusion Sterilizing at high temperature has some impact on the content of effective components in Radix Astragali; Ganoderma lucidum grows well in medium containing Radix Astragali.
Key words：high temperature sterilizing; Radix Astragali; solid fermentation; polysaccharide
20世纪80年代后期南京中医药大学建立了一项使真菌与其它植物、动物类药材间有机结合的复合型中药生产工艺，称为药用真菌“新型固体发酵工程”[1]。利用微生物尤其是药用真菌，使中药发酵，不仅可对中药中的纤维、糖类、蛋白质等加以利用，同时中药中的成分促进或抑制了其次生代谢产物的产生，而且微生物还可对中药中的某些成分进行转化，生产出包含多种活性成分的制剂或新药材[2]。本实验利用药用真菌灵芝对中药黄芪进行固态发酵，灵芝在生长的同时也会合成灵芝多糖和灵芝酸等有效物质，因此菌质有效成分与原培养基有较大的变化，从而可能会改变黄芪的药性，增加了其应用的范围。
1材料与药品
芦丁对照品（国药集团化学试剂有限公司）；黄芪甲苷标准品（中国药品生物制品检定所）；香草醛（Sigma公司）；黄芪（南京先声药店）；其他试剂均为分析纯。
2实验方法
2.1菌质的培养
（1）PDA培养基：马铃薯浸汁25％，琼脂2％，葡萄糖1％，pH6.0；（2）液体种子培养基：豆粉1％，葡萄糖3％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，MgSO40.05 ％，KH2PO4 0.1％；（3）固体培养基：麸皮 20 g，豆粉5 g，黄芪5 g，营养液20 mL。营养液的组成：酵母膏2％，葡萄糖1％，（NH4）2SO4 1％， KH2PO40.1 ％， MgSO4 0.05％。
固体培养基115 ℃灭菌1 h，选择生长良好的灵芝液体种子接种于固体培养基，每瓶固体培养基的接种量约为10 mL。然后置于30 ℃，60％RH条件下的恒温恒湿培养箱中培养。
2.2样品准备
黄芪粉末（40目）以1∶1（w/v）的比例加水后灭菌。共设立4组，1组不灭菌作为对照，其他3组分别于 121、115和100 ℃下灭菌。
2.3多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法[3]，称取20 g黄芪共4份，按2.2处理后加水300 mL，于90 ℃水浴提取1 h，过滤后加水200 mL再次提取1 h。合并滤液并定容至500 mL，量取70 mL液体，离心，上清液加乙醇至最终的乙醇浓度为75％，静置过夜，离心。沉淀加水后于60℃水浴溶解并稀释至合适的浓度（不同发酵时间的菌质同样按上述方法制备样品溶液）。吸取2 mL样品溶液于490 nm处测吸光值。
2.4黄酮含量测定
黄酮在碱性条件下与亚硝酸根和铝离子形成红色络合物[4]。称取10 g黄芪4份，按2.2处理后加入100 mL70％乙醇回流提取1 h。过滤后加80 mL70％乙醇再提取1 h。合并滤液并用70％乙醇稀释到合适的浓度，离心。吸取5 mL上述样品溶液测定其500 nm处的吸光值。
2.5黄芪总皂苷含量测定
采用高氯酸-香草醛法[5]。称取5 g黄芪4份，按2.2处理后后加入适量甲醇冷浸过夜，再用索氏提取法回流抽提4 h。回收提取液并浓缩至干，残渣加水30 mL70 ℃水浴溶解。先用20 mL氯仿萃取2次去除叶绿素及蒽醌类物质，再用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30 mL。合并正丁醇液，用10％氨水40 mL洗涤2次，弃氨液，60 ℃减压蒸干。残渣加甲醇溶解并稀释至合适的浓度。吸取0.3 mL上述样品溶液用上述方法测定其500 nm处的吸光度值。
3实验结果与分析
3.1高温灭菌对中药黄芪的影响
见图1。
图1高温灭菌对有效成分含量的影响
由图1可见，经高温处理的黄芪，多糖和黄酮含量较未处理的高，并且处理温度升高，多糖和黄酮含量也大幅升高，121 ℃下处理较未处理的分别高了56.3％和43.8％。这可能是因为黄芪多糖和黄酮存在于细胞壁内，而植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶质等组成，因此不溶于大部分溶剂，且坚韧而致密。溶剂在液体静压和毛细管作用下通过药材空隙渗透进入细胞组织内，使干细胞膨胀而恢复了细胞膜的通透性。只有当溶剂进入细胞内将有效成分溶解，有效成分才能扩散至溶液中[6]。因此细胞膜成为有效成分溶出的屏障。在灭菌过程中，高温蒸汽使细胞壁产生径向收缩应力，使得细胞壁聚合物的结构发生变化。从化学分析上看，这类结构的变化主要是半纤维素的分解，且分解的速度随分解温度的增加而加剧[7]。因此高温灭菌在一定程度上破坏了黄芪细胞壁的完整性或者大大提高了细胞壁的通透性，使得多糖和黄酮更加容易溶出。
图1还显示，经高温处理的黄芪总皂苷含量较未处理的低很多，且处理温度越高含量越低。121 ℃下处理的较未处理的低63.2％。这可能是因皂苷是由苷元和多糖组成，由糖苷键连接。皂苷极性较大易溶于水、甲醇和乙醇，而皂苷元和次级苷则易溶于石油醚、苯等非极性溶剂[8]。在高温灭菌的过程中，可能使连接苷元和多糖的糖苷键部分断裂生成非极性的皂苷元，从而不能经极性较大的甲醇提取到。
3.2灵芝生长情况的观察
表 1固体发酵过程中灵芝菌丝体生长情况
灵芝生长的变化情况见表1。前7天灵芝的生长速度最快，外观变化也最为明显。本实验室同时研究了香菇的固体发酵，发现其生长速度较灵芝慢很多，需经过20多天菌丝体才连成一片。生长前期速度较快而后期较慢是因为一开始培养基的空隙率较大，氧气的传递非常容易。生长一段时间后菌丝体把培养基连成一片使空隙率降低，氧气传递困难，所以限制了生长速度[9]。
同时考察了不同黄芪添加量对灵芝生长的影响。发现在固态发酵中添加黄芪对灵芝生长的影响不大，灵芝甚至可以在纯黄芪上生长，并没有出现液态发酵中的生长抑制现象。
3.3菌质发酵过程中多糖含量的变化见图2。
图 2菌质中多糖含量随时间的变化
由图2可见，前10 d多糖含量的变化非常剧烈，这是因为在此期间菌丝体快速生长需要消耗大量的营养物质。随着灵芝生长速度的减缓，多糖的消耗降低，多糖的含量也趋于稳定。因为黄芪黄酮和总皂苷在菌质中含量较低且受杂质的影响较大，故未监测这2种有效物质的动态变化。
4小结
初步研究表明，高温处理对中药黄芪有较大的影响。灭菌后，测得多糖和黄酮含量增加，而皂苷含量明显减少。本实验室将进一步利用薄层色谱定性分析高温对黄酮类和皂苷类各物质稳定性的影响，并通过HPLC建立黄芪指纹图谱定量考察高温对黄芪的影响。固态发酵前10 d多糖含量变化很大表明灵芝生长迅速，后期多糖含量趋于平稳表明灵芝生长减缓。因此，我们可以初步推测30 d左右是黄芪灵芝发酵的终点。
参考文献
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