摘要：目的 探讨胃癌N糖的特征性改变及其与证型的相关性。方法 采集138例胃癌患者和128例健康人的静脉血，采用基于DNA测序仪的荧光糖电泳法检测血中N糖变化，比较不同证型患者的N糖差异。结果 所有标本均可得到9个基本N糖糖峰，胃癌患者N糖糖峰Peak1、Peak5、Peak9和Peak2均显著升高（P<0.05，P<0.01），Peak3、Peak6显著降低（P<0.01）。Ⅰ期胃癌的Peak6峰值显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌（P<0.01），Peak9峰值显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌（P<0.01）。肝胃不和型Peak1峰值显著低于痰湿凝结型、瘀毒内阻型和气血双亏型（P<0.05，P<0.01），胃热伤阴型、脾胃虚寒型Peak1峰值显著低于气血双亏型（P<0.01），痰湿凝结型、瘀毒内阻型Peak1峰值显著低于气血双亏型（P<0.05）；肝胃不和型Peak6峰值显著高于胃热伤阴型、痰湿凝结型、瘀毒内阻型和气血双亏型（P<0.01）；气血双亏型Peak9峰值显著高于肝胃不和型、胃热伤阴型和脾胃虚寒型（P<0.05，P<0.01）。结论 胃癌外周血中N糖存在特征性改变，N糖的特征性改变促进了胃癌侵袭转移，与胃癌证型有一定相关性。
关键词：N糖；胃癌；中医证型
基金项目：国家自然科学基金（81102693、81102565）；上海市科委中药现代化专项（09dZ1970800）
通讯作者：刘龙，E-mail：liul513111@163.com
研究发现，人体内的信息流并不终止于蛋白质，蛋白质翻译后修饰是其发挥生物作用的重要过程，其中糖基化是形成活性蛋白质的重要修饰方式之一[1-2]。糖基化是在糖基转移酶的催化下，糖类与蛋白质或酯类等非糖物质的特定部位共价结合形成糖复合物。研究表明，恶性肿瘤细胞表面常存在糖链的特征性改变，这与肿瘤的侵袭转移密切相关[3-5]。笔者以胃癌为研究对象，检测胃癌患者N糖的特征性改变。结合前期研究发现，不同证型胃癌的浸润深度、远处转移情况存在差异[6]，通过探讨胃癌N糖与证型的相关性，初步揭示N糖变化在证型差异中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
138例胃癌病例为2010年6月-2012年12月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院、第二军医大学附属长海医院住院患者。其中男70例，女68例，平均年龄（51.01±6.01）岁；病理分期为Ⅰ期22例、Ⅱ期28例、Ⅲ期63例、Ⅳ期25例；中医证型为肝胃不和型30例、瘀毒内阻型21例、痰湿凝结型22例、脾胃虚寒型21例、胃热伤阴型24例、气血双亏型20例。同时在上述医院收集健康体检人员血清128例作为正常对照组，其中男75例，女58例，平均年龄（50.10±5.95）岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 诊断标准
依据《胃癌诊疗规范》（2011年版）[7]及2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会TNM分期标准[8]制定。
1.3 中医辨证标准
根据前期研究结果[9-10]拟定。①肝胃不和证：主症为胃脘胀痛或窜及两胁，嗳气频繁，嘈杂泛酸；次症为呃逆呕吐，口苦口干，大便不畅；舌质淡红，苔薄白或薄黄，脉沉或弦细。②瘀毒内阻证：主症为胃脘刺痛不移，胃痛日久不愈，大便潜血或黑便；次症为心下痞硬，吐血，皮肤甲错；舌质黯紫，可见瘀斑，脉沉细涩。③痰湿凝结证：主症为胸闷痞满，呕吐痰涎，进食发噎，痰核累累；次症为腹胀便溏，面黄虚肿，口淡无味，乏力纳呆；舌淡红，苔滑腻。④脾胃虚寒证：主症为胃脘隐痛，胃痛喜按喜温，食后胀闷痞满，纳呆少食，大便清稀，腹泻；次症为朝食暮吐，暮食朝吐，面色苍白，肢冷神疲，便溏浮肿；舌淡而胖，苔白滑润，脉沉缓。⑤胃热伤阴证：主症为胃脘灼热，食后疼痛，口干欲饮，大便干燥；次症为胃脘嘈杂，五心烦热，食欲不振；舌红，少苔或苔黄少津，脉弦细数。⑥气血双亏证：主症为神疲乏力，面色无华，头晕目眩；次症为心悸气短，虚烦不寐，自汗盗汗，畏寒肢冷；舌淡、边有齿痕，苔薄，脉沉细无力。
1.4 纳入标准
①经病理组织学或细胞学明确诊断为胃癌；②年龄>18岁；③第一次采血前未经放疗、化疗；④同意参加本试验并签署知情同意书。
1.5 排除标准
①合并其他恶性肿瘤者；②合并心血管、肾、肺、造血系统等严重原发性疾病及精神病患者；③并发呼吸系统、消化系统、泌尿系统急性感染者；④妊娠或哺乳期妇女。
1.6 N糖检测方法
于术前2 d清晨抽取肘静脉血3 mL，3000 r/min离心20 min，分离血清，-80 ℃保存备用。N糖的检测采用基于DNA测序仪的荧光糖电泳法（DSA-FACE）[11]。①寡糖的释放：2 μL血清加入含有2 μL 10 mmoL/L的NH4HCO3（国药集团化学试剂有限公司）缓冲液和3 μL水的PCR反应管中，95 ℃加热5 min，4 ℃放置15 min，加入3 μL PNGaseF （2.2 U/μL，New England Biolabs公司），37 ℃孵育3 h，4 ℃冰浴后加入100 μL水，标记为D管。②标记寡糖：从D管吸取12 μL溶液加入新的PCR管中，开盖60 ℃烘干3 h（可延长时间直至完全干燥），加入2 μL标记溶液（20 mmoL/L APTS，Invitrogen公司）︰1 moL/L NaCNBH3（Sigma公司）=1︰1，37 ℃孵育16 h，加100 μL水终止反应，标记为L管。③去唾液酸：从L管取2 μL溶液加入新的PCR管中，加入0.25 μL 100 mmol/L NH4Ac（国药集团化学试剂有限公司，pH 5.0，Buffer C）、0.25 μL唾液酸酶和2.50 μL水，混匀后37 ℃孵育过夜，加40 μL水振荡混匀，标记为DE管。④DNA测序仪上机检测：取DE管10 μL溶液用ABI 3130测序仪进行片段分析，数据经GeneMapper软件分析。经上述过程处理，每份血清标本均可测得9个峰的糖组图谱，峰值为标准化的峰值（即每个峰的绝对高度值与9个峰值和的比值）。
1.7 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以 —x±s表示，采用t检验或方差分析；计数资料采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌患者外周血中N糖的特征性表达
2.2 N糖与胃癌证型相关性
肝胃不和型中Ⅰ、Ⅱ期胃癌患者较多，胃热伤阴型、脾胃虚寒型、痰湿凝结型中Ⅲ期胃癌患者较多，瘀毒内阻型、气血双亏型中Ⅲ、Ⅳ期患者较多。提示不同证型胃癌其TNM分期构成比存在明显差异（P<0.01）。随着胃癌病情进展，患者证型由肝胃不和型向胃热伤阴型、脾胃虚寒型、痰湿凝结型发展，最终发展为瘀毒内阻型和气血双亏型 N糖糖峰Peak1、Peak6、Peak9在不同证型中差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。其中Peak1峰值肝胃不和型显著低于痰湿凝结型、瘀毒内阻型和气血双亏型（P<0.05，P<0.01），胃热伤阴型、脾胃虚寒型显著低于气血双亏型（P<0.01），痰湿凝结型、瘀毒内阻型显著低于气血双亏型（P<0.05）。Peak6峰值肝胃不和型显著高于胃热伤阴型、痰湿凝结型、瘀毒内阻型和气血双亏型（P<0.01）；Peak9峰值气血双亏型显著高于肝胃不和型、胃热伤阴型和脾胃虚寒型（P<0.05，P<0.01）。由于胃癌证型由肝胃不和向胃热伤阴、脾胃虚寒、痰湿凝结发展，最终发展成为瘀毒内阻、气血双亏型，提示疾病由轻到重的发展过程。Peak1、Peak9随着疾病的发展呈现出逐渐增高的趋势，Peak6则呈现出逐渐降低的趋势。结合表1，Peak1、Peak9的增加、Peak6的减少可能与胃癌的发生、发展有一定相关性。结果。
Peak6、Peak9峰值在不同的胃癌分期中存在明显差异（P<0.01），见表4。其中Ⅰ期Peak6峰值显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期（P<0.01）；Ⅰ期Peak9峰值显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期（P<0.01）。表明随着病情进展，Peak6呈现递减趋势，Peak9呈现递增趋势
3 讨论
Crick于1958年提出了著名的“DNA→RNA→蛋白质”基因信息传递中心法则。研究者发现，翻译后修饰是蛋白质发挥生物作用的重要过程，糖基化过程成为基因信息流的延续。糖蛋白表面的糖链结构与肿瘤的关系越来越受关注。恶性肿瘤细胞表面常存在核心岩藻糖增多、出现不正常的偏二天线糖链、重复N-乙酰氨基乳糖序列的增加等特征性改变，这一现象被称为Warren-Glic现象。随着糖链结构的改变，肿瘤细胞的运动与转移能力也大大增加。当细胞发生恶变时，由于糖基转化酶活性的改变，引起细胞表面糖类结构的变化。进一步研究表明，不同肿瘤其糖链变化具有一定特征，如前列腺癌中高甘露糖结构和岩藻糖结构增多；乳腺癌中高甘露糖、多天线N糖、岩藻糖的增加和唾液酸结构的减少；肝癌与分支α1，3-岩藻糖的升高密切相关；卵巢癌中核心岩藻糖、半乳糖缺失糖结构及唾液酸化的Lewis x抗原显著增加；胰腺癌中也发现岩藻糖基化程度的升高等[12-15]。因此，研究这些肿瘤相关糖链的特征性改变，对于肿瘤早期诊断、进程监测、预后评估及寻找治疗靶点都具有重要意义。本研究表明，胃癌患者外周血中N糖糖峰Peak1、Peak2、Peak5和Peak9均显著升高，而Peak3、Peak6明显降低，提示这些糖峰的改变为胃癌外周血中N糖的特征性改变。
有研究表明，某些糖峰的改变与肿瘤的侵袭转移密切相关。如糖峰Peak9中由于乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基转移至受体α1，6臂的D-甘露糖（Man）上，形成GlcNAc-β1，6-Man-α-1，6分支[16-17]，而GlcNAc-β1，6分支则可以通过降低肿瘤细胞的对纤连蛋白（Fn）的黏附并增强肿瘤细胞的迁移能力，进而促进肿瘤进展。结合本研究结果，随着胃癌分期的加重，Peak9的含量有逐渐增加趋势，表明胃癌淋巴结及远处转移与Peak9的增加有一定相关性。
各证型中不同分期患者的构成分析表明，早期胃癌主要表现为肝胃不和型，而晚期胃癌则主要表现为瘀毒内阻型、气血双亏型。结合各证型N糖的变化情况可以看出，肝胃不和型的Peak9峰值较低，而在瘀毒内阻型、气血双亏型中则明显升高。提示Peak9峰值变化为证型变化的糖组学层面物质基础。同理，Peak6、Peak1的变化也为证型变化提供了物质基础。Peak9、Peak1可视为中医理论中的“邪气”，Peak6可视为中医理论中的“正气”。胃癌早期由于正气充盛，抗邪有力，则Peak1、Peak9峰值较低，Peak6峰值较高，随着病情进展，邪气渐盛，正气日衰，或表现为阻滞经络脏腑，或表现为元气不足，生血无权，但均提示邪气亢盛，因此Peak6明显降低，而Peak1、Peak9峰值显著升高。这为中医药抗肿瘤复发转移的机理研究提供了一个新的方向。
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（收稿日期：2013-12-27；编辑：季巍巍）