摘要[目的] 优化木瓜蛋白酶提取美洲大蠊多糖的工艺参数。 [方法]利用不同梯度木瓜蛋白酶对美洲大蠊进行蜚蠊多糖提取试验，采用单因素和正交试验的方法，考察最佳酶用量、提取时间、温度等相关参数对提取液中多糖的含量的影响，确定蜚蠊多糖提取的工艺。[结果]试验表明，蜚蠊多糖提取的最佳条件为：酶用量为300 μg/g，提取温度60 ℃，提取时间1.0 h。[结论] 研究可为建立高效、实用的蜚蠊多糖提取途径提供技术参考，同时也为美洲大蠊的保健药品及功能性食品开发提供可靠的科学依据。
关键词蜚蠊多糖；酶解法；提取工艺；条件优化
中图分类号TS218文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）34-081-03
美洲大蠊（Periplaneta americana L.），为昆虫有翅亚纲蜚蠊目大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，也称其为石姜、滑虫，各地方都有其不同的俗名，如偷油婆、茶婆子、灶蚂子等[1]。在《本草纲目拾遗》中，蟑螂作为俗名首次出现。蟑螂作为药用昆虫最早记载于《神农本草经》中列为中品，味咸、寒，可治疗寒热症、破积聚、喉咽闭、体寒无子等病症。在历代重要本草典籍如《新修本草》、《本草纲目》中都有记载，近代许多药学专著中也有记述[2]。从美洲大蠊的研究文献来看，目前国内的研究主要集中在美洲大蠊的种群调查、分布、发生规律及防治技术，包括不同种类杀虫剂对美洲大蠊杀灭效率的比较与杀灭机理的研究；基因表达和致敏作用方面的研究；药用价值开发的研究[3-5]等。
笔者采用木瓜蛋白酶水解法对美洲大蠊中的蜚蠊进行多糖提取试验，优化其多糖的提取工艺，为建立高效、实用的蜚蠊多糖提取途径提供技术参考。研究采用了苯酚-硫酸法测定蜚蠊多糖的含量，对比不同提取条件多糖的提取率，为后续美洲大蠊的保健药品及功能性食品开发提供可靠的科学依据。
1材料与方法
1.1材料美洲大蠊药材邮购自河北省安国中药材大市场，经佳木斯大学生命科学学院罗志文副教授鉴定为蜚蠊目鳖蠊科美洲大蠊，原药材及样品现保存于佳木斯大学应用昆虫研究所。
1.2样品预处理
采用精细中药粉碎机对干燥后的美洲大蠊原药材进行粉碎，粉碎后过40目筛，放于55 ℃恒温箱内干燥后保存备用。
预处理是采用石油醚除去脂溶性杂质，按照原料∶石油醚=1∶3（W/V）的量加入石油醚，室温下浸泡10 h后，抽滤，采用旋转蒸发仪浓缩回收石油醚，重复2次，于50 ℃干燥后保存备用[6]。
1.3试验方案
称取处理过的美洲大蠊粉末各5 g，按试验设定的木瓜蛋白酶用量、提取温度、提取时间在恒温水浴锅内进行美洲大蠊的多糖提取，试验完成后，迅速将提取液升温至100 ℃对酶灭活5 min，抽滤，并用50 ℃真空旋转蒸发器浓缩，浓缩液加入3倍量的95 %乙醇在4 ℃冰箱内醇沉24 h，采用大容量低速离心机离心10 min，沉淀物用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得到蜚蠊多糖[7]。
1.3.1蜚蠊多糖提取工艺的单因素试验。
对美洲大蠊提取多糖进行单因素试验，包括木瓜蛋白酶用量、提取时间、提取温度，试验因素水平范围分别为：木瓜蛋白酶用量（A）为100～600 μg/g；提取温度（B）为40～65 ℃；提取时间（C）为0.5～3.0 h。每个影响因子设计3个重复性试验，选用平均值作为试验参数，确定各因素对试验的影响[8]。
1.3.2蜚蠊多糖提取工艺的正交试验。为了进一步优化提取条件，根据单因素试验结果，选择了木瓜蛋白酶用量（A）、提取温度（B）、提取时间（C）这3个因素进行正交优化试验，采用L9（33）正交表安排试验[9]，各因素水平见表 1。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1蛋白酶用量对蜚蠊多糖提取的影响。
由图1可见，随着木瓜蛋白酶用量的逐渐增加，提取得到的蜚蠊多糖含量也随之增大，用量在200～300 μg/g时多糖含量增加的幅度较大，可能是由于随着浓度梯度的幅度增大，细胞内容物的扩散动力就越大，多糖溶出物就越多。而当酶用量为300 μg/g时，多糖的含量最大，达18.101%。
2.1.2提取时间对蜚蠊多糖提取的影响。由图2可见，随着提取时间的逐渐延长，蜚蠊多糖含量也逐渐增加，1.0～2.0 h间蜚蠊多糖含量增加的幅度不明显，而1.5～2.0 h间多糖含量增加的幅度不明显，在酶作用下，多糖随着提取时间延长，所得多糖含量也增加，时间过长，酶活动减弱。在提取时间3.0 h时，多糖含量17.532%。
2.1.3温度对蜚蠊多糖提取的影响。
温度对多糖的提取具有显著影响。由图3可见，随着提取温度的升高，蜚蠊多糖含量也随之增加，从45 ℃到50 ℃增加的幅度较明显，可能由于随着温度的升高而酶活力逐渐加强。温度显著降低时，多糖含量变化不显著，而当温度升高到一定程度，可能会影响到木瓜蛋白酶的活性，多糖提取率呈逐渐下降趋势。提取温度为50 ℃时，多糖含量最高，为20.135%。
2.2正交试验
由表 2试验结果可知，不同因素对蜚蠊多糖含量影响的顺序为：A>B>C，即酶用量对蜚蠊多糖含量影响最大，其次为提取温度也影响着蜚蠊多糖的提取含量，提取时间影响较小。通过试验，我们最后确定了蜚蠊多糖含量最佳的提取工艺条件为A3B3C1，即酶用量为300 μg/g，提取温度60 ℃，提取时间1.0 h时提取的蜚蠊多糖含量最多。
3结论与讨论
酶解法是近几年来提取动物多糖的先进技术，这种方法的优点是不会造成多糖的损失，可减少原材料的浪费。而试验表明，不同材料提取次数过多，不仅浪费提取液和时间，还会产生大量滤液，浓缩较为困难。因此，选择合理的提取次数不仅节省原药材，降低成本投入，也不会明显影响多糖的提取量。
影响蜚蠊多糖提取率的因素主要有：木瓜蛋白酶用量、提取温度、提取时间等因素。通过正交试验得出，提取温度对蜚蠊多糖含量影响最大，其次为木瓜蛋白酶用量，提取时间和提取次数对多糖提取影响较小，蜚蠊多糖最佳提取工艺条件A3B3C1，即酶用量为300 μg/g，提取温度60 ℃，提取时间1.0 h时提取的蜚蠊多糖含量最多。
通过酶解法来提取蜚蠊多糖工艺的优化研究，可以获得非常理想的优质蜚蠊多糖，为后期开展蜚蠊多糖的分离纯化、多糖成分分析及对荷瘤小鼠抗肿瘤活性等试验积累试验数据，也为将来开发优良的昆虫多糖药物及功能性食品服务。
参考文献
[1]
肖小芹.美洲大蠊生物学特性及药用价值研究[D].长沙：中南大学，2007.
[2] 萧庆慈，肖泓，刘昆平.蜚蠊的古今应用[J].云南中医学院学报， 2012， 35（1）： 55-59.
[3] 高永翔，扈晓宇，钟森.蟑螂提取物对急性肝损伤动物模型的干预[J].药物研究，2006，15（10）：3-4.
[4] 张丹.美洲大蠊抗肿瘤活性成分及其结肠定位片的研究[D].成都：成都中医药大学，2014：1-106.