[摘要] 目的 探讨黄芪多糖对糖尿病足部溃疡成纤维细胞增殖功能的影响。方法 选择糖尿病足部溃疡患者15例，取患者创面边缘全厚皮片，分离、培养、传代成纤维细胞。比较不同浓度黄芪多糖对成纤维细胞增殖功能的影响。 结果 各组间吸光度A值比较差异有显著统计学意义（F=21.357，P＜0.01），其中100μg/mL组和500μg/mL组显著高于对照组，而500μg/mL组又显著高于100μg/mL组（t=3.926、7.254、4.359，P均＜0.01）。结论 黄芪多糖能够促进糖尿病足部溃疡成纤维细胞的增殖，并且随着浓度的增加，促进作用越强。
[关键词] 黄芪多糖；糖尿病；溃疡；成纤维细胞
[中图分类号] R587.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2014）15-0124-03
Effect of astragalus polysaccharide on proliferation of fibroblast at diabetic foot ulceration
WU Xia
Glycyresis Department，Donggang City TCM Hospital in Liaoning Province，Donggang 118300，China
[Abstract] Objective To discuss effect of astragalus polysaccharide on proliferation of fibroblast at diabetic foot ulceration. Methods Fifteen cases with diabetic foot ulceration were selected. Full thick skin graft at edge of ulcer were cut to separate， foster and passage fibroblast. Effects of different concentration of astragalus polysaccharide on proliferation of fibroblast were compared. Results Absorbance of four groups had significant difference（F=21.357，P＜0.01）. Absorbancea of group of 100μg/mL and group of 500μg/mL were higher than control group， and that of group of 500μg/mL was higher than group of 100μg/mL（t=3.926，7.254，4.359，P all ＜0.01）. Conclusion Astragalus polysaccharide can improve roliferation of fibroblast at diabetic foot ulceration， and the effect increase with concentration of astragalus polysaccharide increasing.
[Key words] Astragalus polysaccharide； Diabetic； Ulceration； Fibroblast糖尿病足主要指初期的糖尿病患者在没有出现周围神经病变和周围血管病变前已经出现足部感染、化脓、溃烂等症状。黄芪注射液主要用于治疗病毒性心肌炎、心功能不全、免疫功能下降的慢性肝炎等，也可用于治疗白细胞减少症和血小板减少性紫癜以及慢性肾炎、肾病综合征、糖尿病肾病等[1]。研究显示，其外敷用于治疗糖尿病足溃疡时能促进溃疡的愈合，减少截肢率。但是具体的机制还不十分明确。本研究主要研究黄芪多糖对糖尿病足部溃疡成纤维细胞增殖功能的影响。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选择2013年3~6月在我院治疗的糖尿病足部溃疡患者20例，糖尿病病程（6.1±2.0）年。入院时空腹血糖（12.6±2.5）mmol/L，餐后2h血糖（16.8±4.2）mmol/L，糖化血红蛋白（9.9±0.8）%。
1.2标本采集
取疮口边缘全厚皮片，大小为1.0 cm×1.0 cm，在含100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS液中漂洗，去除脂肪组织，剪成碎块，大小为0.5 cm×0.5 cm，使用0.25%醋酸氯己啶消毒，PBS液冲洗，消化液消化，分离真皮表皮，去除表皮。真皮培养液中消化、过滤、离心、弃上清。加入培养液中，离心，弃去上清，重复3次。调整细胞浓度，检查细胞活力。按照1×106/mL接种到含胎牛血清、青霉素、链霉素的培养液中，37℃，5%CO2饱和湿度下培养。细胞进行传代，取4~6代细胞进行实验。
1.3实验方法
将对数生长期的细胞进行消化、离心，制成悬液，接种在96孔板中，没开孔0.5×104个，37℃，5%CO2，恒温培养箱中培养24h，加入含有不同浓度黄芪多糖的培养液，每个浓度4个复孔，浓度分别为20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL，培养24h。另选1组仅加入含血清的培养液作为对照组。采用MTT方法观察成纤维细胞的生长情况，在570nm下测吸光度A值。
1.4统计学方法
采用SPSS15.0软件包进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，不同浓度采用方差分析，组间采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
对照组吸光度值为（0.412±0.021），20μg/mL组为（0.418±0.025），100μg/mL组为（0.462±0.014），500μg/mL组主要为（0.510±0.017）。各组比较差异有显著统计学意义（F=21.357，P＜0.01），其中100μg/mL组和500μg/mL组显著高于对照组，而500μg/mL组又显著高于100μg/mL组（t=3.926、7.254、4.359，P均＜0.01）。见图1。
图1 各组570nm吸光度A值
3讨论
糖尿病足部溃疡主要指初期糖尿患者，没有出现周围神经病变和周围血管病变，却已出现足部感染、化脓、溃烂等症状。主要病因有神经病病变、血管病变、循环障碍、免疫障碍、皮肤中促进皮肤生长的胰岛素生长因子-1（IGF-1）减少等，其中主要是神经和血管病变在发生发展过程中发挥重要作用。足溃疡程度与患者的糖尿病患者全身神经病变、缺血性病变程度和经济收入密切相关。糖尿病足反映糖尿病造成足部神经、大血管的病变，并导致局部组织的破溃、感染、骨髓炎、坏死等，局部治疗通常非常困难，很多患者最后需要进行截肢或截趾，足部感染扩散导致全身脓毒症甚至危及生命。糖尿病足治疗困难，难以愈合。成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞（mesenchymal cell）分化而来。对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有十分重要的作用。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化（ectopic ossification）。
黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，其有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。黄芪多糖是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖。作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用[2，3]。黄芪多糖（APS）可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，黄芪皂苷能促进淋巴结B细胞增殖分化和浆细胞抗体形成。黄芪多糖明显增强巨噬细胞吞噬发光强度并抑制PGE2的释放，但进一步促进TNF的释放。黄芪在体液免疫、增强单核巨噬细胞的吞噬活性、对体细胞和自然杀伤细胞释放免疫活性物质、诱生干扰素和白细胞介素等多方面表现出多种生理活性。黄芪能促进巨噬细胞的吞噬功能，能促进B细胞的增殖并且抑制总补体活性，对白细胞介素有诱生作用。黄芪多糖是黄芪中免疫活性较强的一类物质，它能增强吞噬细胞的吞噬功能，从脾及胸腺重量、溶血素、血凝素以及脾细胞总数及空斑形成细胞测定看出，黄芪多糖、红芪多糖均能对环磷酰胺或强的松龙的免疫抑制作用有完全及部分对抗作用。黄芪多糖可通过调节含量以及促进磷脂酰肌醇代谢，进而提高创伤后活化T淋巴细胞内IL-2mRNA及IL-2RmRNA的基因转录表达，这可能是黄芪多糖纠正创伤后细胞免疫功能低下的机制之一。黄芪对干扰素系统有明显的刺激作用。黄芪还能促进各类血细胞的生成、发育及成熟过程，促进骨髓的造血功能[4]。对体外培养肝细胞，黄芪能促进RNA及蛋白质合成，提示其能延长细胞寿命，增强细胞代谢推迟老化。黄芪可促进小鼠血清和蛋白质更新。
在本次实验中，当黄芪多糖浓度达到100μg/mL时，其对成纤维细胞的增殖促进作用明显增加，而浓度达到500μg/mL浓度时，促进作用进一步增强，提示黄芪多糖能够增加溃疡部位成纤维细胞的增殖，并且随着浓度的增加，其增强作用逐渐增加，这可能是黄芪外敷治疗糖尿病足部溃疡患者能够促进溃疡愈合的机制之一。张正军等[5]研究显示100 μg/mL黄芪多糖可降低MMP-2、MMP-9活性及其蛋白的表达。肖正华等[6]研究显示糖尿病足部溃疡难以治愈的原因与伤口渗出液中IL-1β量过高、成纤维细胞增殖能力明显受抑有关，黄芪多糖外敷可以降低伤口渗出液中IL-1β浓度，显著缩短溃疡GT和HT，降低截肢率。周倩等[7]研究显示APS在（10～160）μg/mL浓度范围内可促进体外培养的糖尿病足溃疡Fb增殖，增加胶原合成，且呈量效、时效依赖关系；过高浓度（≥640μg/mL）的APS对Fb增殖、胶原合成产生抑制作用。朱贵明等[8]研究显示黄芪多糖通过减慢染色体末端限制性片段（TRF）长度缩短速度，提高衰老人胚肺二倍体成纤维细胞活力，发挥抗衰老作用。李光善等[9]研究显示黄芪多糖对实验性糖尿病大鼠创面成纤维细胞增殖有促进作用，但是联合桂皮醛和川芎嗪效果更好。
综上所述，黄芪多糖能够促进糖尿病足部溃疡部位成纤维细胞的增殖，从而促进溃疡愈合，降低截肢风险。本研究局限性主要是纳入研究的黄芪多糖浓度较少，没有研究分析进一步增加浓度会不会出现抑制作用，希望在今后的研究中进一步完善。
[参考文献]
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[8]朱贵明，江旭东，王迪迪，等. 黄芪多糖对衰老HDF细胞染色体末端限制性片段长度的影响[J]. 中国老年学杂志，2012，32（8）： 1635-1637.
[9]李光善，李萍，盛巡，等. 黄芪多糖、桂皮醛、川芎嗪对实验性糖尿病大鼠创面成纤维细胞增殖作用的影响[J]. 中国中医基础医学杂志，2004，10（4）： 20-22.
（收稿日期：2014-01-03）