[摘要] 该文建立了基于人肺腺癌A549细胞和超高效液相色谱线性离子阱静电场轨道阱质谱（UHPLC/LTQ Orbitrap MS）的靶细胞捕集化学表征技术，用于分析预测姜黄中抗肺癌的潜在活性成分。将A549靶细胞和姜黄提取物一起孵育培养，根据活性成分可以与靶细胞膜有特异性结合或者进入靶细胞内的原理，用液质联用方法可对培养后的细胞结合成分进行分析。因姜黄中的主要活性成分为脂溶性成分，在与A549细胞共同孵育时出现吸附于培养瓶内壁的现象，造成空白溶液有干扰。该文通过细胞消化后多次离心和转移，解决了空白干扰问题，成功从姜黄提取物中筛选出3个与A549细胞结合的成分，经鉴定，分别为双脱甲氧基姜黄素、脱甲氧基姜黄素和姜黄素，系姜黄中主要的抗肺癌活性成分。该文结果表明通过改进的方法，可以解决脂溶性成分因吸附瓶壁而造成假阳性的情况，是对现有靶细胞捕集化学表征技术的有力补充。
[关键词] 靶细胞捕集化学表征； 人肺腺癌A549细胞； 液质联用法； 静电场轨道阱质谱； 姜黄； 活性成分
从中药复杂体系中快速、高效地筛选出活性成分，一直是中药现代化研究的热门领域[12]。靶细胞捕集化学表征技术是近几年发展起来的一种符合中医药整体观及多成分、多靶点整体作用特点的中药活性成分筛选技术[2]，该技术主要包括如下步骤：①在模拟生理环境下将活性细胞与中药提取物共孵育一定时间，②除去未与细胞结合的游离成分，③收集并破碎细胞，④采用合适的溶剂提取与细胞结合的成分，⑤对结合成分（群）进行分析鉴定。目前，该技术已成功用于筛选丹参中人脐静脉内皮细胞（ECV 304）、小鼠单核巨噬细胞（Raw 264.7）和正常人肝细胞（HL 7702）的结合成分[3]，丹红注射液中小胶质细胞的结合成分[4]，丹参中Caco2细胞的结合成分[5]，栀子中肝细胞的结合成分[6]，管花蒲公英中人子宫颈癌细胞（Hela）、人胃腺癌细胞（MK1）的结合成分[7]，玄参中内皮细胞的结合成分[8]，黄芪中Caco2细胞、红细胞的结合成分[9]以及栀子中血小板的结合成分[10]。
在现有报道的文献中，去除未与细胞结合的游离成分时主要采用生理盐水（或含一定比例的DMSO）冲洗多次直至冲洗液中未检出中药成分为止。但是，对于中药脂溶性成分，采用该方法时可能无法去除吸附在细胞培养瓶内壁上的游离成分，但最后采用有机溶剂提取细胞结合成分时，这些吸附于瓶内壁的游离成分会一起被提取出来，造成假阳性结果。为此，本文采用细胞消化后多次离心和转移，并设置药材空白对照等手段对该方法进行了完善和优化，并以姜黄和人肺腺癌A549细胞为研究对象，对中药中的脂溶性细胞结合成分进行了筛选和验证。
姜黄为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，具有破血行气，通经止痛的功效，用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛[11]。文献报道，姜黄的不同类型成分具有很强的抗A549肿瘤细胞活性[1214]，因此研究姜黄的A549细胞结合成分（群），对姜黄的进一步开发和利用具有重要意义。
1 材料
岛津LC20ADXR高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Thermo Dionex UltiMate 3000快速液相色谱仪（UHPLC）、线性离子阱静电场轨道阱质谱仪（LTQ Orbitrap Velos Pro，美国Thermo Fisher Scientific公司）；Mettler Toledo XPE205电子分析天平；KODO JAC 4020P超声波清洗器；二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo公司）。
姜黄素对照品，购于中国食品药品检定研究院，批号1108239802。
乙腈（色谱纯，Merck）；二甲基亚砜（DMSO，分析纯，南京化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，杭州化学试剂有限公司）；试验用水为MilliQ系统制备（电阻率18.2 MΩ.cm@25 ℃）；3批姜黄样品（批号JH03，JH05，JH06）来源于广西和四川，经浙江省食品药品检验研究院郭增喜主任中药师鉴定为姜科植物姜黄C.longa 的干燥根茎；人肺腺癌A549细胞（中国科学院细胞库）；胎牛血清（美国HyClone公司）；RPMI1640培养基（美国GIBCO公司）；胰蛋白酶（美国HyClone公司）。
2 方法
2.1 姜黄供试品溶液制备 精密称取姜黄样品粉末0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声提取1 h，静置放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，精取上清10 mL，蒸干，加DMSO 0.5 mL超声使溶解，再加19.5 mL无血清培养液，摇匀，静置，精取上清2 mL，加8 mL无血清培养液，摇匀，即得。
2.2 A549细胞培养及姜黄中细胞结合成分捕集 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液贴壁培养A549细胞于25 cm2斜颈细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，细胞长满培养瓶75%后传代培养。取对数生长期的A549细胞用于细胞结合成分捕集实验，先用37 ℃预热的无血清RPMI1640培养液于细胞培养瓶中轻轻冲洗细胞一次，洗去细胞表面黏附的代谢产物，加无血清RPMI1640培养液5 mL，置于CO2培养箱中稳定培养0.5 h，倒掉培养液，加入姜黄供试品溶液5 mL，置于CO2培养箱中孵育1.5 h，收集孵育液倒入15 mL离心管中，剩余贴壁细胞加1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化3 min，待细胞悬浮后收集倒入同一15 mL离心管中，1 000 r·min-1离心3 min，弃上清，沉淀加3 mL生理盐水（含2.5% DMSO）轻轻冲洗悬浮细胞，细胞悬浮液转移至新的15 mL离心管中，1 000 r·min-1离心3 min，弃上清，同样方法重复冲洗2次（每次细胞悬浮液均转移至新的15 mL离心管），收集第3次冲洗液（离心后的上清液）备用。沉淀加2 mL双蒸水于-80 ℃反复冻融3次破碎细胞，加入10 mL甲醇，颠倒混匀，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，即得细胞结合成分提取液。不加姜黄供试品溶液，以无血清培养基代替姜黄供试品溶液，同法制得细胞空白对照溶液。不用细胞，只用姜黄供试品溶液，同法制备姜黄空白对照溶液。将第3次冲洗液、细胞结合成分提取液、细胞空白对照溶液和姜黄空白对照溶液用HPLC或UHPLC/LTQ Orbitrap质谱检测。
2.3 色谱质谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～15 min，48%～51% B；15～17 min，51% B；17～20 min，51%～74% B；20～45 min，74% B；45～46 min，74%～95% B；46～65 min，95% B；65～66 min，95%～48% B；66～78 min，48% B。检测波长：270 nm；流速：0.8 mL·min-1；进样体积10 μL。电喷雾离子源（ESI），高分辨检测模式（FTMS），分辨率6万 FWHM，离子源参数：离子源温度350 ℃；鞘气流速35 arb；辅助气流速10 arb；反吹气流速0 arb；I Spray电压4.0 kV；毛细管温度300 ℃；采集模式为正离子模式；一级质谱扫描范围m/z 100～800；二级MS/MS质谱采用HCD模式，碰撞电压为45%。
3 结果与讨论
3.1 姜黄HPLC特征图谱分析 采用岛津LC20ADXR HPLC按2.3项中的色谱条件对姜黄供试品溶液进行分析，检测波长选择270 nm[15]，所得的姜黄HPLC特征图谱见图1。从图1可见，姜黄主要检测到7个色谱峰，经对照品比对，3号峰为姜黄素峰。
3.2 细胞结合成分筛选专属性试验 姜黄中以姜黄素为代表的活性成分极性小，难溶于水，因此在姜黄供试品制备时加入了2.5%的DMSO用于助溶，经试验，该浓度的DMSO对A549细胞的影响较小，不影响细胞结合成分捕集试验的开展。本文首先采用文献报道的通用方法进行细胞结合成分的捕集，具体如下：在姜黄供试品溶液与A549细胞共孵育后，倒掉药液，用生理盐水（含2.5%DMSO）5 mL轻轻冲洗6次，收集第6次洗脱液备用。洗过的细胞加2 mL双蒸水于-80 ℃反复冻融3次破碎细胞，加入10 mL甲醇，摇匀，提取细胞结合成分，12 000 r·min-1离心10 min后取上清，得细胞结合成分提取液。不加姜黄供试品溶液，以无血清培养基代替姜黄供试品溶液，同法制得细胞空白对照溶液。不用细胞，只用姜黄供试品溶液，同法制备姜黄空白对照溶液。采用该方法制备的样品按2.3项中的色谱条件进行分析，结果发现第6次冲洗液和细胞空白对照溶液无干扰，但姜黄空白对照溶液出现干扰，见图1。分析原因可能是姜黄所含成分的脂溶性强，吸附在细胞培养瓶壁，用生理盐水（含2.5%DMSO）难以将其洗净，最后用甲醇提取时将瓶壁上吸附的成分洗脱下来，造成假阳性的情况。为此，对未结合的游离成分去除方法进行了改进（详见2.2项），简单来说就是将孵育后的细胞消化后转移至新的离心管中，然后通过多次冲洗和转移，去除吸附在壁上的游离成分。改进后，冲洗液、细胞空白对照溶液和姜黄空白对照溶液均未出现干扰，见图2A～C，该结果表明通过改进的方法，可以解决脂溶性成分因吸附瓶壁而造成假阳性的情况，是对现有靶细胞捕集化学表征技术的有力补充。从图2可见，姜黄中能与A549细胞结合的成分主要有3个，即1，2，3号峰，且3批姜黄（批号JH03，JH05，JH06）筛选结果一致，表明方法重复性良好。
A.姜黄空白对照溶液；B.细胞空白对照溶液；C.第3次冲洗液；D～F.细胞结合成分提取液，姜黄批号依次为JH03，JH05，JH06。
图2 冲洗方法改进后姜黄中A549细胞结合成分筛选的HPLC图
Fig.2 HPLC chromatograms for screening of A549 cell binding compounds from Curcuma longa after changing the flushing method
3.3 A549细胞结合成分鉴定 采用UHPLC/LTQ Orbitrap MS对姜黄中的A549细胞结合成分进行了分析和鉴定。LTQ Orbitrap MS作为高尖端的分析仪器在成分分析领域，特别是成分的定性分析方面备受关注和重视。LTQ Orbitrap MS的分辨率高达10万，而且能对目标物进行多级质谱分析，因此可在没有标准物质的情况下通过精确质量数和多级碎片可对未知物进行快速筛查与结构确认[16]。姜黄UHPLC/LTQ Orbitrap质谱分析的TIC图谱和一级二级质谱图，见图3。通过LTQ Orbitrap质谱所得高精确相对分子质量、以及对照品和文献比对[17]，对A549细胞结合的3个成分进行了鉴定，分别为双脱甲氧基姜黄素、脱甲氧基姜黄素和姜黄素，其质谱信息见表1，结构式见图4。
4 结论
靶细胞捕集化学表征技术以中药提取物为研究对象，选择靶细胞作为捕集器，特异性捕集中药中与靶细胞发生亲和作用的成分群，对捕集到的目标活性成分群，进一步应用LCMS和生物信息手段等进行结构分析和活性评估，是有别于现今业界主流的依据成分理化性质差别进行分离的还原论研究模式。但现有方法主要涉及中药水溶性成分的筛选，对于脂溶性成分的筛选和评价罕有报道。本文通过细胞消化后多次离心和转移等手段，解决了中药脂溶性成分进行细胞结合成分筛选时出现的假阳性情况，并通过设置药材空白对照对方法进行了验证，从而完善了现有的靶细胞捕集化学表征技术。
本文曾采用UHPLC/LTQ Orbitrap质谱对姜黄特征图谱中的成分进行分析，结果无论采用ESI和APCI离子源7号峰均未响应，推测可能由于该化合物极性小、含量低、难电离等因素所致。对于4～6号峰，质谱分析结果显示其离子分别为m/z 217.158 61， 219.174 32， 219.174 29[M+H]+，推测分子式分别为C15H20O， C15H22O， C15H22O，测定误差均小于0.1。曾尝试采用相对分子质量同为218（m/z 219[M+H]+）的吉马酮对照品进行比对，发现保留时间未匹配。从相对分子质量和极性来看，4～6号峰可能为挥发油类成分。
本文研究显示，姜黄中能与A549细胞结合的成分为3个姜黄素化合物，即姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素。据文献报道[1314， 18]，姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素具有显著的抑制A549细胞增殖活性和诱导A549细胞凋亡作用，从而表明本文筛选结果的可靠性。基于本文研究结果，可进一步研究姜黄中的姜黄素及其类似物在抗肺癌作用中存在的协同或拮抗作用，多角度分析中药多成分、多靶点作用特点。
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[责任编辑 丁广治]