摘 要：目的 探讨姜黄素对结肠侵袭和失巢凋亡的影响。
方 法：应用姜黄素处理人结肠癌细胞系HCT116后，采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖，采用Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭性，采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测癌细胞失巢凋亡。
结 果：姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和侵袭能力，且与浓度相关。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果显示，姜黄素可诱导结肠癌细胞失巢凋亡，且与浓度和时间相关。
结 论：姜黄素可抑制人结肠癌细胞侵袭，诱导失巢凋亡是其机制之一。
关键词：结肠肿瘤；姜黄素； 侵袭； 失巢凋亡
Effects of Curcumin on Invasion and Anoikis Resistance of Human Colon Cancer Cell HCT116
ABSTRACT:AIM To study the effects of curcumin on anoikis resistance in human colon cancer cells.
METHODS: After colon cancer HCT116 cells were treated with curcumin,the growth of anchorage independence of colon cancer HCT116 cells was examined in soft agar colony formation,and apoptosis of colon cancer were evaluated by terminal deoxynucleatidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling(TUNEL) and DNA ladder.
RESULTS:Curcumin could significantly inhibit the growth of anchorage independence of colon cancer HCT116 cells in soft agar colon foamation in a dose-dependent.Curcumin could induce apoptosis of colon cancer cells from DNA ladder and TUNEL assay,which were in a time- and dose- dependent manner.
CONCLUSIONS: Curcumin could inhibit the growth of anchorage independence of colon cancer HCT116 cells,which was related to anoikis.
KEY WORDS: colon cancer;curcumin;invasion； anoikis
细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）脱离黏附接触或者是接触不完全后出现的凋亡现象，被称为失巢凋亡（Anoikis）。“Anoikis”为希腊语“无家可归者（homelessness）”[1～3]。正常上皮细胞或内皮细胞脱离于细胞ECM的联系时会发生失巢凋亡，而大多数来源于上皮或内皮的肿瘤细胞则丧失了这种特性。恶性肿瘤细胞之所以有别于正常细胞，出现局部侵袭和转移，其重要原因之一是肿瘤细胞可以逃避失巢凋亡，即抗失巢凋亡。姜黄素（curcumin）系从中药姜黄中提取的酚性色素，有抗氧化、抗促癌、抗突变、抗炎、降血脂等广泛药理作用。近年来的研究表明，姜黄素可以预防和治疗多种恶性肿瘤［4-6］。但是尚不清楚姜黄素对结肠癌细胞失巢凋亡的影响。为此，我们采用姜黄素处理结肠癌HCT116细胞，探讨了其对抗失巢凋亡的影响，旨在了解姜黄素对结肠癌细胞的作用及可能的分子机制。
材料和方法
1.材料姜黄素（Curcumin），购自Sigma公司。以少量DMSO 融解，配置成10 mmol/L的溶液，置于－4℃保存。临用时，以完全细胞培养液稀释姜黄素到所需浓度，使DMSO终浓度<0.1%。对照组培养液为含105％新生灭活小牛血清的RPMI-1640培养液，其中DMSO终浓度<0.1%。人结肠癌细胞HCT116购自中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所。多聚羟乙羟乙基甲基丙烯酸树脂（polyhydroxyethylmethacrylate，Poly-HEMA）购自Sigma公司。60 mm细菌有盖培养皿（petri-dish）购自美国Grainer公司。DNA抽提试剂盒，上海申能博彩公司。
2.细胞培养及处理 人结肠癌细胞HCT116培养于含10％新生小牛血清的RPMI 1640（含青、链霉素各100 U/ml）中，37℃、5％CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。待细胞对数生长期，设空白对照组和不同浓度的实验组，采用不同浓度的姜黄素处理结肠癌细胞后，然后分别检测软琼脂集落形成、失巢凋亡。
3.软琼脂集落形成试验
3.1 制备细胞悬液 将所有结肠癌细胞（处理组及对照组）用含0.01%EDTA的0.25%胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2 X 103/ml，置室温备用。
3.2 制备底层琼脂将1％的琼脂凝胶于微波炉完全溶化后放置45℃水浴中，温度平衡后与等体积45℃预温的汉20％新生小牛血清的RPMI 1640培养液混匀，加入6孔板中，每孔4ml，置超净台中室温放置，令其充分凝固。剩余的琼脂粉/培养基混合物置于42℃水浴中待用。
3.3 制备上层琼脂：取42℃保温的琼脂粉/培养基混合物1.2 ml与0.8 ml细胞悬液混合，迅速混匀，取1 ml铺于底层琼脂上，每个样品做一复孔。同时做空白阴性对照及溶剂对照。置培养板于超净台室温待其充分凝固后，移入37℃、5％、CO2孵箱中培养。
3.4计数：倒置显微镜下随机计数每组样品10个视野中的集落数，取其平均数作比较。结果采用t检验。
4.体外侵袭试验 参照Albini[8]等的方法。该试验在改良的Boyden 小室中进行。Boyden小室的上下室之间隔以直径为3mm的无PVP的聚碳酸酯膜（孔径为8μm），膜上铺匀1:2稀释的基底膜胶（Matrigel）。下室加预先制备的NIH3T3细胞培养上清液作为趋化因子，上室加入50～800μl待测的肿瘤细胞悬液。置于37C、5%CO2培养箱中温育12 h，弃去上室液体，取出聚碳酸酯膜，用棉签仔细擦尽膜上Matrigel及未穿过的细胞，甲醛固定5 min，HE染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。
5.细胞失巢凋亡特性检测
5.1多聚-HEMA的培养皿铺制[1-2]将多聚-HEMA溶于无水乙醇，制备成10 mg/ml的多聚- HEMA溶液。将培养皿用PBS洗3遍，然后加上2 ml 多聚- HEMA溶液包被。
5.2琼脂糖凝胶电泳 将HCT116细胞和MDCK细胞分别用含0.01%EDTA的0.25%胰酶消化，吹打均匀，制成5x105/ml的单细胞悬液。将2 ml细胞接种于多聚- HEMA的培养皿中，同时取2 ml普通培养皿中作为阴性对照。48 h后，收集细胞，采用DNA抽提试剂盒按照说明书操作提取DNA，无水乙醇沉淀。25℃琼脂糖凝胶电泳，电压60V，1.5h。
5.3 TUNEL检测将MDCK细胞和结肠癌细胞采用胰酶（5 mmol/L EDTA）消化后，重悬于无血清RPMI1640培养液中，吹打均匀，将1x 105个细胞/well种于多聚-HEMA包被的培养皿中，放入培养箱继续培养。将100 μl细胞悬浮液加入覆盖有细胞加样槽的玻片上，4℃，800 r/min离心2min。3.7％甲醛固定30s。余操作同TUNEL试剂盒。凋亡指数（Apoptosis Index，AI）计算：凋亡细胞数/总细胞数 x 100%。
6.统计学处理 采用SPSS8.0软件对数据进行处理。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异性显著。
结果
1.姜黄素对结肠癌细胞软琼脂集落形成的影响结肠癌HCT116细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落。将细胞采用姜黄素处理后，进行软琼脂集落培养试验，与对照组比较，处理组集落生长呈剂量依赖性减少。（结果见图1）
2 姜黄素对结肠癌细胞侵袭的影响 收集细胞，采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，姜黄素作用后穿过滤膜的细胞数明显下降(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。（图2）
3姜黄素对结肠癌细胞抗失巢凋亡的影响悬浮培养的结肠癌细胞相互之间容易聚集，形成较致密的细胞团块。琼脂糖凝胶电泳未见DNA断裂条带。说明结肠癌细胞HCT116具有一定的的抗失巢凋亡的特性。
3.1琼脂糖凝胶电泳结果 图3所示，收集经姜黄素处理的细胞，转移到板上培养，12后采用琼脂糖凝胶电泳检测，发现基因组DNA凝胶电泳显现明显的梯状图谱。2.5 μmol/L时即可呈现微弱的梯状电泳带，随着浓度的增加，条带变得更为清晰。
1:Control;2,3,4：curcumin 2.5,5,10μmol/L;M：DNA maker
3.2 TUNEL结果 将不同浓度姜黄素处理的的悬浮培养的癌细胞离心到载玻片上，TUNEL试剂盒染色，发现经转染处理的悬浮结肠癌细胞凋亡指数明显高于对照组悬浮培养的细胞，且呈浓度和时间依赖性。当姜黄素浓度为2.5,5,10μmol/L时，凋亡指数分别为5.19±0.56，9.58±0.61，15.3±0.81，与对照组集落数1.95±0.56比较，姜黄素处理组凋亡指数明显增高(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。说明，姜黄素可促进结肠癌细胞失巢凋亡，即增强了结肠癌细胞对失巢凋亡的敏感性。
讨论
肿瘤细胞可以锚着不依赖性生长。肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关。本研究发现，经姜黄素处理的结肠癌细胞软琼脂集落数和穿膜细胞数减少明显减少，且呈浓度依赖性。说明姜黄素可一定程度上抑制结肠癌细胞的锚着依赖性增殖和侵袭能力。
癌细胞侵袭是一个复杂的过程，涉及到很多机制。近年来，失巢凋亡引起人们重视。失巢凋亡的意义在于防止这些脱落的细胞种植于其他不适当的地方继续生长。然而很多肿瘤细胞从瘤体上脱落后并不会发生凋亡，尤其是容易发生转移的恶性肿瘤细胞，可以迁徙到其他部位再次生长。这种存在于某些肿瘤细胞的抗失巢凋亡现象，是肿瘤获得转移增殖功能特性的主要因素,被认为是肿瘤转移发生的重要原因之一[7,8，9]。同样地，结肠癌细胞在体内增殖转移可能是失巢凋亡失败的结果。
研究失巢凋亡现象一般在包被有多聚-HEMA的petri-dish培养皿上进行。多聚-HEMA是一种阴离子聚合物，具有均匀的非离子特性，铺在容器的底部可阻止细胞接触和ECM的沉淀，可阻止细胞贴壁，细胞呈悬浮状态，从而诱发失巢凋亡。我们发现HCT116细胞无论是贴壁培养还是悬浮培养均未见明显的凋亡现象，即表现为抗失巢凋亡。
本研究先将不同浓度的姜黄素处理结肠癌细胞后，转到包被有多聚-HEMA的petri-dish培养皿中培养。于不同时间收集细胞，分别采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测。琼脂糖凝胶电泳显示，经不同浓度姜黄素处理的癌细胞基因组DNA凝胶电泳显现明显的梯状图谱。TUNEL结果显示凋亡指数增加，且呈浓度和时间依赖性。由此说明，姜黄素增强了癌细胞对失巢凋亡的敏感性。
由此，本研究提示，姜黄素可抑制结肠癌细胞锚着不依赖性增殖和恶性侵袭，其机制与诱导失巢凋亡有关。
图1姜黄素对结肠癌HCT116细胞软琼脂集落形成的影响
图2姜黄素对结肠癌细胞侵袭的影响( ±s，n＝3)
图3琼脂糖凝胶电泳测定（12h）
参考文献
[1] Frisch SM, Francis H。Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis[J]。
J Cell Biol,1994 124(4):619-26.
[2]Frisch SM, Screaton RA。Anoikis mechanisms[J]。Curr Opin Cell Biol,2001,13(5):555-562。
[3] Rak J, Mitsuhashi Y, Erdos V, et al。Massive programmed cell death in intestinal epithelial cells induced by three-dimensional growth conditions: suppression by expression of a mutant c-H-ras oncogene[J]. J Cell Biol, 1995,131: 1587-1598。
[4]袁守军，韩锐。姜黄素的癌化学预防作用。国外医学。肿瘤学分册1997,24(5): 264-268。
[5]张建清。姜黄素的抗诱变、抗癌作用。国外医学·卫生学分册。2000,27(3): 161-164。
[6]许建华，赵蓉，柯丹如，等。姜黄素对人肝癌Bel7402细胞杀伤动力学及周期时相的影响。 福建医科大学学报1998.09.15; 32(3): 236-239。
[7] Zhu Z, Sanchez-Sweatman O, Huang X, et al。Anoikis and metastatic potential of cloudman S91 melanoma cells[J]。Cancer Res, 2001,61(4):1707-1716。
[8] Rosen K, Rak J, Jin J, et al。Down-regulation of Bak plays a critical role in the growth of the ras-induced m alignant phenotype in intestinal epithelial cells[J].Curr Biol, 1998,8: 1331-1334。
[9] Rosen K, Rak J, Leung T,et al。Activated ras prevents down-regulation of Bcl-XL triggered by detachment from the extracellular matrix: a TGF- -mediated mechanism of ras-induced resistance to anoikis in intestinal epithelial cells[J]。JCell Biol, 2000,149: 447-455。