［摘要］目的：研究番荔枝Annona squamosa的化学成分，并对分离化合物进行活性筛选。方法：综合运用各种色谱方法分离纯化番荔枝中的化学成分；采用NMR等波谱方法鉴定其结构；运用SRB法测定化合物对肿瘤细胞体外增殖能力的抑制作用。结果：从番荔枝皮乙醇提取物中分离得到11个化合物，分别是annosquamosin C（1），15，16epoxy17hydroxyentkauran19oic acid（2），16，17dihydroxyentkauran19oic acid（3），annosquamosin A（4），entkaur16en19oic acid（5），19norentkauran4ol17oic acid（6），16hydroxyentkauran19oic acid（7），ent15βhydroxykaur16en19oic acid （8），annosquamosin B（9），ent16β，17dihydroxykauran19al（10），16，17dihydroxyentkauran19oic acid methyl ester（11）。抗肿瘤活性实验表明，化合物1，2，3，5，9对人肺癌95D细胞的体外增殖能力均具有不同程度的抑制作用，化合物5的活性最强，IC50为7.78 μmol·L-1；化合物2，5，9对人卵巢癌A2780细胞有抑制作用，其中化合物2和9的抑制作用较强，IC50分别为0.89，3.10 μmol·L-1。结论：化合物2，8，11分别为首次从该科、该属和该种植物分离得到；化合物5对人肺癌95D细胞的抑制作用较强；化合物2和9对人卵巢癌细胞A2780的抑制作用较强。
［关键词］番荔枝；贝壳杉烷型二萜；抗肿瘤活性
番荔枝Annona squamosa为番荔枝科Annonaceae番荔枝属Annona植物，是一种可以食用的热带水果。原产于美洲，现在中国海南、广东、广西、云南等地广泛种植[1]。可用于治疗痢疾、癫痫、便秘、出血、发烧以及溃疡；还有抗肿瘤、抗生育和堕胎的作用[25]。番荔枝中含有番荔枝内酯[6]、贝壳杉烷型二萜[7]、生物碱[8]、环肽[9]、木脂素[10]、黄酮[11]等。已有研究表明番荔枝内酯具有较强的抗肿瘤活性[6]，但是很少有人对番荔枝中的二萜成分进行细胞毒活性研究。本文对番荔枝的化学成分进行了较系统的研究，从中分离得到11个化合物，通过NMR，MS鉴定了其结构，并对部分化合物进行了抗肿瘤活性筛选。结果表明化合物1，2，3，5，9对人肺癌95D细胞具有抑制作用，其中化合物5的活性最强；化合物2，5，9对人卵巢癌A2780细胞具有抑制作用，其中化合物2和9活性较强。
1材料
Bruker Avance III 500型超导核磁共振仪（TMS为内标）；Micromass Quattro三重四极杆检测器连接ESI 离子源（Micrrmass，Manchester，UK）；柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶均系青岛海洋化工厂生产；MCI Gel（日本三菱化学有限公司）；反相硅胶（默克公司）；凝胶Sephadex LH20（法玛希亚公司）；柱色谱试剂均为分析纯；药材购于海南省，经浙江大学药学院莫建霞高级实验师鉴定为番荔枝A. squamosa。
药理实验所用细胞株由浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所实验室培养并长期保存于液氮中。95D和A2780分别培养于RPMI1640和DMEM（Invitrogen，Grand Island，NY，USA）含10%灭活的胎牛血清（杭州四季青），L谷氨酰胺（Invitrogen）2 nmol·L-1，青霉素100 U·mL-1和链霉素100 mg·L-1。
2提取分离
干燥的番荔枝皮4.7 kg，95%乙醇浸提3次，每次7 d，提取液减压浓缩，得浸膏714 g，加水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分别得到石油醚萃取物142 g，乙酸乙酯萃取物242 g，正丁醇萃取物122 g。正丁醇部分经MCI柱色谱（10%～90%乙醇），分为2个部分（A，B）。A部分（5 g）经硅胶柱色谱（二氯甲烷甲醇，100∶1～40∶1），分为3个部分，A1（570 mg），A2（185.3 mg）和A3（82.3 mg）。3个部分分别经ODS柱色谱（45%乙醇）纯化，得到化合物1 （22 mg），2 （38.9 mg）和3（23.9 mg）；B部分（2.5 g）经硅胶柱色谱（石油醚乙酸乙酯，25∶1）后，再经Sephadex LH20柱色谱（二氯甲烷甲醇，1∶1），ODS柱色谱（50%乙醇）纯化，得到化合物4 （5 mg）。乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱（石油醚丙酮 100∶1～20∶1）分为3个部分（Ⅰ～Ⅲ），Ⅰ部分出现白色针状结晶，为化合物5（5 g）；Ⅱ部分经硅胶柱色谱（环己烷乙酸乙酯，25∶1）依次得到化合物6（337 mg），7（480 mg）和8（50 mg）；Ⅲ部分（18 g）依次经MCI柱色谱（40%乙醇），硅胶柱色谱（环己烷乙酸乙酯，20∶1；石油醚二氯甲烷甲醇，180∶5∶1），ODS柱色谱（45%乙醇），分别得到化合物9（440 mg），10（42 mg）和11（120 mg）。
3 结构鉴定
化合物1白色粉末。ESIMS m/z 293[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.97（3H，s，H19），1.12（3H，s，H18），2.00（1H，d，J=11.5 Hz，H14a），2.20 （1H，s，H13），3.70（1H，d，J=3.8 Hz，H17a），3.72（ 1H，d，J=4.3 Hz，H17b）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：39.7（C1），19.2（C2），40.6（C3），72.5（C4），57.2（C5），19.5（C6），41.5（C7），44.3（C8），57.8（C9），40.0（C10），19.8（C11），26.2（C12），37.2（C13），43.0 （C14），43.9（C15），44.3（C16），64.4（C17），23.0（C18），17.3（C19）。上述数据与文献[12]报道的annosquamosin C基本一致。
化合物2白色粉末。ESIMS m/z 335 [M+H]+。 1HNMR（C5D5 N，500 MHz）δ：1.14（3H，s，H20），1.34（3H，s，H18），2.28（2H，m，H2），3.10（1H，s，H15），4.03（1H，d，J=12.8 Hz，H17a），4.40（ 1H，d，J=12.8 Hz，H17b）；13CNMR（C5D5N，125 MHz）δ：41.5（C1），20.2（C2），39.1（C3），44.0（C4），57.1（C5），22.0（C6），36.9（C7），44.4（C8），50.0（C9），41.5（C10），19.1（C11），27.4（C12），36.9（C13），33.0（C14），65.5（C15），66.4（C16），60.5（C17），29.8（C18），180.5（C19），16.2（C20）。上述数据与文献[13]报道的15，16epoxy17hydroxyentkauran19oic acid基本一致。
化合物3白色粉末。ESIMS m/z 335 [M+H]+。1HNMR（CD3OD，500 MHz），δ：1.02（3H，s，H20），1.22（3H，s，H18），2.06（1H，s，H13），2.17（1H，d，J=13.1 Hz，H14a），3.64（1H，d，J=11.4 Hz，H17a），3.75（1H，d， J=11.4 Hz，H17b）；13CNMR（CD3OD，125 MHz）δ：41.9（C1），20.3（C2），38.2（C3），44.6（C4），58.1（C5），23.4（C6），43.3（C7），45.8（C8），57.3（C9），40.8（C10），19.6（C11），27.3（C12），46.2（C13），39.2（C14），53.7（C15），82.9（C16），66.8（C17），29.4（C18），180.4（C19），16.2（C20）。上述数据与文献[7，13]报道的16，17dihydroxyentkauran19oic acid基本一致。
化合物4白色针晶。ESIMS m/z 363 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.88（3H，s，H20），0.99（3H，s，H18），2.11（3H，s，COCH3 ），3.91（1H，d，J=11.3 Hz，H17a），4.04（1H，d，J=11.3 Hz，H17b），9.73（1H，s，H19）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：41.9（C1），18.5（C2），34.4（C3），48.6（C4），56.7 （C5），19.8（C6），39.9（C7），43.8（C8），55.7（C9），39.6（C10），18.9（C11），26.7（C12），41.5（C13），38.6（C14），52.5（C15），78.7（C16），71.3（C17），24.4（C18），206.1（C19），16.4（C20），171.5 （COCH3）， 21.1（COCH3 ）。上述数据与文献[7]报道的annosquamosin A基本一致。
化合物5白色针晶。ESIMS m/z 303 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.96（3H，s，H20），1.25（3H，s，H18），2.17（1H，d，J=14.1 Hz，H14a），2.64（ 1H，s，H13），4.74（1H，s，H17a），4.80（1H，s，H17b）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：41.4（C1），19.2（C2），37.9（C3），44.0（C4），57.2（C5），22.0（C6），41.0（C7），44.0（C8），55.2（C9），39.8（C10），18.6（C11），33.3（C12），43.8（C13），39.8（C14），49.1（C15），156.1（C16），103.1（C17），29.1（C18），184.0（C19），15.7（C20）。上述数据与文献[7，14]报道的entkaur16en19oic acid基本一致。
化合物6白色针晶。 ESIMS m/z 307 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：1.12（3H，s，H19），1.15（3H，s，H18），2.12（1H，d，J=11.7 Hz，H14a），2.56（1H，s，H13），2.93（1H，dt， J=12.1，6.2 Hz，H16）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：42.0（C1），19.6（C2），41.2（C3），70.5（C4），56.8（C5），18.0（C6），41.1（C7），44.4（C8），54.6（C9），39.9（C10），17.4（C11），30.9（C12），39.9（C13），39.2（C14），40.9（C15），45.4（C16），180.3（C17），27.5（C18），17.4（C19）。上述数据与文献[14]报道的19norentkauran4αol17oic acid基本一致。
化合物7白色粉末。ESIMS m/z 321 [M+H]+。1HNMR （CDCl3，500 MHz）δ：0.98（3H，s，H20），1.18（3H，s，H17），1.33（3H，s，H18），2.12（1H，d，J=13.2 Hz，H14a）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：43.3（C1），19.3（C2），39.2（C3），44.7（C4），58.5（C5），23.3（C6），43.3（C7），46.5（C8），58.5（C 9），40.9（C10），19.3（C11），27.9（C12），49.5（C13），38.5（C14），57.5（C15），79.9（C16），24.4（C17），29.5（C18），181.7（C19），16.3（C20）。上述数据与文献[14]报道的16hydroxyentkauran19oic acid基本一致。
化合物8白色粉末。ESIMS m/z 319 [M+H]+。1HNMR（CD3OD，500 MHz）δ：0.96（3H，s，H20），1.26（3H，s，H18），2.17（1H，d，J=12.3 Hz，H14a），2.74（1H，s，H13），5.08（1H，s，H17a），5.21（1H，s，H17b）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：40.8（C1），19.2（C2），37.9（C3），43.9（C4），57.1（C5），21.1（C6），36.6（C7），47.9（C8），53.5（C9），39.9（C10），18.4（C11），32.7（C12），42.4（C13），35.4（C14），82.9（C15），160.4（C16），108.5（C17），29.1（C18），183.8（C19），16.0（C20）。上述数据与文献[15]报道的ent15βhydroxykaur16en19oic acid数据基本一致。
化合物9白色针晶。ESIMS m/z 331[M+Na]+。1HNMR（CD3OD，500 MHz），δ：1.16（3H，s，H19），1.20（3H，s，H18），2.11（1H，s，H13），3.31（1H ，d，J= 11.3 Hz，H17a），3.42（1H，d，J= 11.3 Hz，H17b）；13CNMR（CD3OD，125 MHz）δ：41.4（C1），20.5（C2），42.8（C3），72.8（C4），57.9（C5），19.6（C6），42.3（C7），44.8（C8），56.1（C9），41.9（C10），19.1（C11），28.0（C12），40.5（C13），80.8（C16），70.6（C17），30.9（C18），17.8（C19）。上述数据与文献[7]报道的annosquamosin B基本一致。
化合物10白色针晶。ESIMS m/z 321[M+H]+。 1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.89（3H，s，H20），0.99（3H，s，H18），2.12（ 1H，s，H13），2.14（1H，d， J=13.5 Hz，H14a），3.40（1H，d，J=10.8 Hz，H17a），3.48（1H，d，J=9.3 Hz，H17b），9.74（1H，s，H19）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：42.0（C1），19.0（C2），34.4（C3），48.6（C4），56.7（C5），19.8（C6），39.6（C7），43.5（C8），55.6（C9），39.9（C10），18.5（C11），26.7（C12），40.8（C13），38.5（C14），52.6（C15），79.9（C16），70.0（C17），24.4（C18），206.1（C19），16.4（C20）。上述数据与文献[7，14]报道的ent16β，17dihydroxykauran19al基本一致。
化合物11白色针晶。ESIMS m/z 351 [M+H] +。1HNMR（CD3OD，500 MHz）δ：0.87（3H，s，H20），1.18（3H，s，H18），2.04（1H，s，H13），2.15（1H，d，J=13.4 Hz，H14a），3.65（3H，s，COOCH3 ），3.61（1H，d，J=11.0 Hz，H17a），3.72（1H，d，J =11 Hz，H17b）；13CNMR（CD3OD，125 MHz）δ：41.8（C1），20.2（C2），38.2（C3），45.7（C4），58.1（C5），23.3（C6），43.2（C7），45.0（C8），57.3（C9），40.7（C10），19.6（C11），27.2（C12），46.2（C13），39.1（C14），53.7（C15），82.9（C16），66.8（C17），29.0（C18），179.6（C19），16.1（C20），51.7（COOCH3 ）。水解后的产物点板检测，Rf与化合物3一致；除甲氧基以外的碳谱数据与化合物3基本一致。故结构确定为16α，17dihydroxyentkauran19oic acid methyl ester。
4抗肿瘤实验
4.1方法采用磺酰罗丹明（SRB）法检测候选化合物对人肺癌细胞95D和人卵巢癌细胞A2780的体外增殖能力的抑制作用。
将对数生长期的人肺癌细胞95D和人卵巢癌细胞A2780消化后，吹打成单细胞悬液，接种于96孔培养板；5×103细胞/孔，每孔培养基100 μL，37 ℃，5％ CO2培养箱中培养过夜待细胞贴壁后，加入适当浓度的受试化合物在培养箱中再培养3 d。10%三氯醋酸固定1 h。用双蒸水洗涤，干燥后，每孔加入100 μL SRB溶液（4 g·L-1），室温染色20 min，1%醋酸洗涤，干燥。每孔加入100 μL 10 mmol·L-1 Tris溶液使SRB溶解。酶标仪检测各孔A（检测波长515 nm）。
4.2实验结果按下列公式计算抑制率：抑制率=（A对照-A给药）/A对照×100%，并计算IC50，见表1。
化合物1，2，3，5，9对人肺癌95D细胞体外增殖能力均表现出不同程度的抑制作用，其中化合物5的活性最强；化合物2，5，9对人卵巢癌A2780细胞有抑制作用，其中化合物2和9的活性较强。
5讨论
已有的研究表明，迄今已从该植物中发现25个贝壳杉烷型二萜[7，12]，表明该类化合物是其中的特征成分之一。本文从番荔枝皮的正丁醇部分和乙酸乙酯部分分离得到的11个化合物中，有3个为首次从该植物中发现，其中化合物8为首次从本属植物中分离得到；化合物2为首次从本科植物中分离得到，进一步丰富了该植物的化学成分。
化合物1，2，3，5，9可以抑制人肺癌细胞95D的增殖，化合物2，5，9可以抑制人卵巢癌A2780细胞的增殖。近年来对番荔枝抗肿瘤活性的研究多集中在番荔枝内酯类成分[17]，本文实验结果证明，番荔枝中的贝壳杉烷型二萜也是抗肿瘤的重要活性成分之一。已有文献报道贝壳杉烷型二萜具有显著的细胞毒活性， 对很多细胞株而言，其活性中心为β不饱和酮[18]；本文发现的化合物均不含β不饱和酮结构单元，但部分化合物对人肺癌细胞95D和人卵巢癌细胞A2780增殖具有不同程度的抑制作用，说明β不饱和酮对这2株肿瘤细胞的增殖抑制不是必需的活性基团，其构效关系有待于进一步深入研究。
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