[摘要] 目的 探讨三叶青提取物对体外培养的人宫颈癌Hela细胞诱导凋亡的作用。 方法 四氮噻唑蓝（MTT）法检测三叶青提取物对Hela细胞的抑制增殖作用及其时效、量效关系；倒置显微镜下观察细胞形态学变化。结果 随着三叶青提取物浓度升高，作用时间的延长，其对Hela细胞的增殖抑制率逐渐增强，与对照组比较有明显差异（P<0.05），Hela细胞形态出现明显的凋亡特征性改变。 结论 三叶青提取物对人宫颈癌Hela 细胞具有明显的体外细胞毒作用，其毒性作用与药物的浓度和作用时间呈明显正相关。
[关键词] 三叶青；Hela细胞；诱导凋亡；MTT法
[中图分类号] R73-36； R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）23-0004-03
[Abstract] Objective To study the effect of extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of human cervical cancer Hela cells. Methods MTT assay was used to determine the inhibitory rate of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of HeLa cells. The morphology of cell apoptosis was observed by inverted microscope. Results The inhibition ratio of tumor cell was gradually increased with the longer extension time or the increase of dosages of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg the treatment groups was significant differentce（P<0.05） compared with the control group. Under inverted microscope， the tumor cells showed a special phenomenon of cellular apoptosis. Conclusion The extracts of tetrastigma hemsleyanum diels et gilg has a significant toxicological effect on human cervical cancer Hela cells， which positively relates with its concentration and effect time.
[Key words] Tetrastigma hemsleyanum diels et gilg； Hela cells； Apoptosis-inducing； MTT assay
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤， 发病率在女性恶性肿瘤中居第二位[1]。目前临床治疗使用的化疗药物多有较强的毒副作用和耐药性问题，从传统中药中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物新药开发的热门课题[2]。三叶青是我国浙江、江西、广西等少部分地区独有的珍稀中药品种[3]，可用于治疗肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物[4，5]。有研究发现三叶青总黄酮能显著地抑制肝癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的生长，且细胞有明显的凋亡特征性改变[6-9]。本研究主要探讨三叶青提取物对宫颈癌Hela细胞的体外细胞毒作用，为其临床应用于宫颈癌治疗提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
MTT 购于Sigma公司；RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、胎牛血清购于Gibco公司；HF/60W二氧化碳培养箱，由香港Hecnforce公司生产；OLYMPUS（IX50-S8F2）倒置显微镜，酶标仪（型号XMARK）由美国BIO-RAD生产。
1.2 三叶青提取物制备
三叶青药材购自宁波鄞州医药药材公司，称取三叶青药材1000 g，采用碱性稀醇浸提，酸化沉淀法[9]得三叶青提取物6.9 g。
1.3细胞株及细胞培养
人宫颈癌Hela细胞株购自上海中科院细胞生化所，接种于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素各100 mg/L的RPMI1640培养基中，置于37℃饱和湿度，含5%CO2的细胞培养箱培养，当Hela细胞长满瓶壁80%以上时，加入0.25%的胰蛋白酶消化，制成1×105/mL细胞悬液。
1.4实验分组及药物处理
实验分为加药组和对照组（不含药物，加等体积培养液），加药组每孔加入不同浓度的三叶青提取物，终浓度分别为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、16 mg/mL，每组5个复孔。
1.5 四氮噻唑蓝（MTT）比色法
根据参考文献[10，11]方法取对数生长期Hela细胞，接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，培养过夜，待细胞贴壁后，加入各浓度的药液100 μL。对照组加100 μL的培养液，培养24 h或48 h后，弃上清液，在各孔中加入向每孔加入MTT储液50 μL（5 mg/mL），震荡混匀后，继续培养4 h小心吸除各孔培养液，每孔加入DMSO 200 μL，振荡器上震荡溶解10 min，空白调零，用酶标仪测波长570 nm处各孔吸光度，按公式细胞增殖抑制率（IR）=（1-A 加药组的平均值/A对照组的平均值）×100%计算出细胞增殖抑制率。
1.6光学显微镜下形态学观察
取处于对数生长期的Hela细胞，5个不同浓度药物（同MTT）分别处理，并设不加药物只加等量培养液的为对照组细胞，分别于倒置显微镜下观察细胞并照相，比较加药组和对照组Hela细胞的形态变化。
1.7统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，试验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间及组内比较采用方差分析（F检验），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1细胞增殖抑制率结果及方差分析
由表1可见随着三叶青提取物浓度的增大，处理时间的延长，Hela细胞OD值逐渐减少，表明其对Hela细胞生长的抑制作用随着浓度的增大，处理时间的增加而加强。与对照组比较，除了1mg/mL药物处理24 h组外，其他各药物处理组的OD值均显著低于对照组（P<0.05）。表明三叶青提取物浓度本实验所采用的浓度范围之内对Hela细胞的抑制作用有明显的剂量及时间依赖。经不同浓度三叶青提取物作用后的各组Hela细胞，细胞增殖抑制率结果及方差分析结果如表2、3所示。
3 讨论
宫颈癌是危害女性健康的生殖系统最常见的恶性肿瘤，每年全球约有20多万女性死于宫颈癌。目前临床多采用以手术和放疗为主、化疗为辅的治疗方案，但常规放化疗对肝、肾等器官的毒副作用大，且易产生多药耐药性，治疗效果不尽如人意[13]。寻找疗效好同时毒副作用较小的天然药物有重要的临床意义。近年来中药诱导凋亡已成为肿瘤研究领域的一个新热点，不少学者以体外细胞株为研究对象发现中药可通过影响细胞周期、改变细胞凋亡基因及蛋白的表达或相关酶的活性等途径来有效抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[14]。三叶青为浙江省地方性传统中药，最近因其被发现具有抗多种肿瘤的生物活性而被广泛关注。有报道显示[15]，三叶青提取物与肺癌 A549细胞共培养48 h，其细胞活性显著性降低，且DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带，是细胞凋亡的一个重要标志。汪珍等[8]观察三叶青提取物对人结肠癌RKO细胞的影响，结果显示：三叶青提取物能显著地抑制人结肠癌细胞系RKO细胞的生长，并能下调 Bcl-XL、上调Bid来诱导凋亡，具有浓度依赖性。冯正权等[16]通过体外培养人胃癌SGC-7901细胞，检测三叶青黄酮对其生长的抑制作用，结果表明：三叶青黄酮能显著抑制 SGC-7901细胞增殖，具有浓度依赖性，且细胞周期分析显示有明显的凋亡峰出现，并能降低细胞上清液中基质金属蛋白酶-2的含量。此外，三叶青提取物能够改善荷瘤小鼠机体的细胞免疫功能，激活机体的抗氧化作用途径，具有一定的体内抑瘤效果，其高剂量干预后的抑瘤率达 36.06%[17]。
本研究通过定量（MTT）和定性（显微镜观测）的方法，对5种不同浓度的三叶青的提取物作用后的Hela细胞凋亡特征性改变进行了研究，发现实验所采用浓度范围内三叶青提取物均有抑制Hela细胞增殖作用，且呈浓度/时间-效应正相关。关于增殖抑制率的评价一般认为[1]，<30%为不敏感（耐药），>50%为敏感，30%～50%为中度敏感，由本实验检测结果可知，8 mg/mL的三叶青提取物作用24 h后对Hela细胞的生长即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且随其浓度的增加及作用时间的延长越敏感。通过光学显微镜观察Hela细胞形态，可见细胞变圆、细胞核固缩、核碎裂及凋亡小体形成等凋亡形态，随着浓度的增加该特征越明显。因此，本研究结果显示三叶青提取物对Hela细胞具有很好的肿瘤细胞毒作用，是很有潜力的抗宫颈癌药物。但本研究中的方法仅为初步观察细胞凋亡的指标[18]，本课题组拟进一步通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测法定性分析凋亡细胞的DNA裂解，通过流式细胞仪定量分析三叶青作用后的细胞凋亡率及其细胞周期改变，并检测三叶青提取物作用后凋亡相关基因表达的改变以明确其促凋亡的分子机制，为开发研制宫颈癌治疗的新候选药物进一步提供可靠的理论和试验依据。
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（收稿日期：2014-02-27）