[摘要]目的：分析Notch1在黑素瘤發展过程中的作用和机制。方法：采用RT-PCR检测Notch1 mRNA在黑素瘤和正常黑素细胞中的表达，采用慢病毒转染技术构建Notch1过表达的黑色素瘤细胞系，CCK法检测细胞增殖能力，Transwell检测细胞侵袭能力，划线法检测细胞迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡能力，Western blot检测细胞Notch1过表达对PI3K/AKT信号通路中AKT磷酸化水平的影响。结果：黑素瘤细胞系MM200、Mel-CV、A2058和A375细胞中Notch1 mRNA水平明显高于正常黑素细胞系HemN-MP（P<0.05）。黑素瘤细胞A2058细胞中Notch1水平升高后，细胞的增殖速率显著提高，在48h、72h和96h转染组细胞增殖能力明显高于对照组（P<0.05）；Transwell结果显示Notch1水平升高可以显著增加穿过小室膜A2058细胞数量（P<0.05）；划线法结果显示24h转染组细胞迁移率明显高于对照组（P<0.05）；流式细胞检测结果显示转染组细胞早期凋亡率明显低于对照组（P<0.05）。Notch1水平增加后，AKT蛋白磷酸化水平明显提高，说明Notch1能够促进PI3K/AKT信号通路的激活。加入了Notch信号通路特异性阻断剂DAPT后，能够有效抑制Notch1过表达引起的AKT蛋白磷酸化的升高。结论：Notch1能够调节PI3K/AKT信号通路通过促进黑素瘤的发展，本研究为临床治疗黑素瘤提供了新的思路。
[关键词]黑素瘤；Notch1；增殖；侵袭；凋亡；迁移；信号通路
[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）01-0093-04
Notch1 Regulating PI3K/AKT Signaling Pathway Promoting the Development of Melanoma Cells
Dilixiati·KUERBAN，CHEN Zhao
（Department of Burn Injury，Xinjiang Uiger Municipal People"s Hospital，Urumqi 830001，Xinjiang，China）
Abstract： Objective To analyze the role and mechanism of Notch1 in the development of melanoma. Methods Notch1 mRNA expression in normal melanocytes and melanoma was detected by RT-PCR. Slow virus transfection technique was used to construct Notch1 expression of melanoma cell lines. Using CCK method to detect cell proliferation ability， Transwell to detect cell invasion ability， marking method to detect cell migration ability， flow cytometry to detect cell apoptosis， Western blot to detect cell Notch1 over expression of PI3K/AKT signal pathway of AKT phosphorylation level. Results The expression levels of Notch1 mRNA in melanoma cell lines MM200， Mel-CV， A2058 and A375 were significantly higher than that in normal melanocyte lines HemN-MP （P<0.05）. When the level of Notch1 in the melanoma cell A2058 cells was increased， the cell proliferation rate was significantly increased， and the proliferation capacity of the transfection group at 48h， 72h and 96h was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. Transwell results showed that increased Notch1 level significantly increased the number of A2058 cells passing through the compartment （P<0.05）. The results showed that the cell migration rate in the 24h transfection group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. Flow cytometry test showed that the early apoptosis rate in transfection group was significantly lower than that in control group （P<0.05）. After the increase of Notch1 level， AKT protein phosphorylation level was significantly increased，suggesting that Notch1 could promote the activation of PI3K/AKT signaling pathway.The addition of Notch signaling pathway specific blocking agent DAPT can effectively inhibit the increase of AKT protein phosphorylation caused by Notch1 overexpression. Conclusion Notch1 can regulate PI3K/AKT signaling pathway by promoting the development of melanoma， which provides a new idea for clinical treatment of melanoma.
Key words： melanoma； Notch1； proliferation； attacks； apoptosis； migration； signal pathway
黑素瘤是一种常见的恶性皮肤肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，其年增长率在3%～5%，易出现转移。研究报道[1]称8%～46%的黑素瘤患者易出现脑转移，50%～80%晚期黑素瘤患者可出现肝转移，其死亡率居皮肤恶性肿瘤的第一位，出现转移的患者中位生存时间仅为8～9个月，5年生存率低于5%，严重威胁人们健康。随着靶向药物的出现，患者的生存期在一定程度上能够延长，但效果有限。文献报道[2-3]称Notch信号通路能够调节细胞的生长和分化，也有研究报道称其在乳腺癌和结肠癌中会出现异常活化，PI3K/AKT信号通路作为经典的信号通路，在肿瘤发展过程中起着重要作用[4-5]。相关文献[7]称黑素瘤细胞与正常皮肤细胞相比，会分泌大量新蛋白，促进葡萄糖代谢，进而促进细胞增殖和侵袭，因此研究Notch1蛋白在黑素瘤中的功能以及分子机制将有助于临床开发新的靶向药物。本研究主要观察Notch1蛋白在黑素瘤细胞增殖、侵袭、迁移以及凋亡过程中的作用，以探讨其在调控黑素瘤细胞生物学特性过程中的分子机制。
1 材料和方法
1.1 细胞及主要抗体、试剂：黑素瘤细胞系（MM200、Mel-CV、A2058和A375）和黑素细胞系HemN-MP采购自中科院上海细胞研究所；兔抗Notch1、AKT和p-AKT单克隆抗体购自美国Abcam公司；Notch通路特异性阻断剂2，4-二氨基-5-苯噻唑（DAPT）购于Peprotech公司；酶标仪和流式细胞仪均采购自Bio-Rad公司。所有细胞均培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件：37℃，5% CO2。
1.2 方法
1.2.1 慢病毒细胞转染：转染前1d，将293T细胞接种于2个6cm培养皿中，细胞数为5×103个；24h后将pIRSE2-EGFP-Puro MTA1以及pIRSE2-EGFP-Puro空载对照质粒分别转染入293T慢病毒包装细胞；12h后更换新鲜细胞培养基，48h后收集病毒上清，用0.45µm孔径过滤器过滤后，-70℃分装、储存。将生长良好的细胞消化计数后，以细胞密度为2.5×103个/孔接种到6孔板中，置于37℃、5% CO2及完全湿度的培养箱中。待细胞融合度达到80%～90%时进行转染，将2种病毒分别转染到细胞中，48h后消化离心重悬细胞，然后加入含有嘌呤霉素的培养基进行培养筛选，从而获得稳定过表达Notch1的细胞系。
1.2.2 RT-PCR检测Notch1 mRNA：细胞经过培养或处理后，按照Trizol说明书提取细胞内的总RNA，然后通过一步法转录为cDNA，采用SYBR Green进行荧光定量PCR，采用Ct分析数据，内参采用GAPDH，每个标本做3个复空。Notch1：上游引物：5’-GTGACTGCTCCCTCAACTTCAAT-3’，下游引物：5’-CTGTCACAGTGGCCGTCACT-3’；GAPDH：上游引物：5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3’，下游引物：5’-TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC-3’。
1.2.3 Western blot检测Notch1、AKT和p-AKT：细胞经过培养或处理后加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白浓度，取50µg进行电泳，结束后转膜，5% BSA封闭2h，加入一抗、二抗（孵育，ECL显影后扫描，蛋白相对表达量经内参校正后使用Quanity-One软件进行分析，GAPDH作为内参。
1.2.4 CCK8法检测细胞增殖能力：取传代一致的细胞，调整细胞浓度至1×103接种于96孔板中，每孔100µl，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每隔2d更换1次培养基。在培养4h、24h、48h、72h和96h时，加入10µl的CCK8溶液，继续培养4h，检测450nm的OD值。
1.2.5 划痕法检测细胞迁移能力：取传代一致的细胞，调整细胞浓度至1×103接种于6孔板，采用10µl的微量加样枪头画出无细胞区，采用磷酸缓冲液吸取划痕后脱落的细胞并进行拍照。培养24h后拍照，观察细胞迁移能力。遷移率=（0h划痕距离-24h划痕距离）/0h划痕距离×100%。
1.2.6 Transwell检测细胞侵袭能力：分别采用未铺和铺有Matrigel胶的Transwell小室用于细胞迁移实验，用培养基重悬细胞，饥饿24h，然后调整细胞浓度为1×103/ml，将100µl细胞悬液接种于Transwell小室的上室内。在24孔板中加入400µl培养基，然后将Transwell小室放入24孔板中，在细胞培养箱中常规孵育24h，取出Transwell小室用0.01M的PBS轻柔冲洗，再用棉签轻柔擦除上室内粘附的细胞，在95%的乙醇中固定。最后采用结晶紫染色，在倒置显微镜下，随机选择5个视野（200×），观察穿透小室的细胞数量。
1.2.7 流式细胞检测细胞凋亡能力：细胞转染48h后，采用预冷的PBS洗涤细胞，加入300µl的缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100ul置于流式管中，分别加入5µl的Annexin V-FITC和5µl的PI，混匀室温孕育15min，加入400µl PBS，上机检测细胞凋亡情况。
1.3 统计学分析：数据分析采用SPSS 16.0，绘图采用Graphpad Prism5.0，计量资料采用均数±标准差来表示，P<0.05表示具有统计学意义。
2 结果
2.1 黑素瘤细胞系和黑素细胞系中Notch1 mRNA水平：黑素瘤细胞系：MM200、Mel-CV、A2058和A375细胞中Notch1 mRNA水平明显高于正常黑素细胞系HemN-MP（P<0.05），提示Notch1可能与黑素细胞病变为黑素瘤细胞密切相关，并有可能参与了黑素瘤细胞的增殖和侵袭等生物学行为。见图1。
2.2 稳定过表达Notch1黑素瘤细胞系A2058构建：转染48h后，转染组中Notch1蛋白水平和Notch1 mRNA水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示成功构建了Notch1过表达的细胞株。见图2。
2.3 过表达Notch1促进黑素瘤细胞A2058增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡：CCK8法检测细胞增殖结果显示，黑素瘤细胞A2058细胞中Notch1水平升高后，细胞的增殖速率显著提高（见图3A），在48h、72h和96h转染组细胞增殖能力明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示Notch1表达能够促进黑素瘤细胞增殖。Transwell结果显示Notch1水平升高可以显著增加穿过小室膜A2058细胞数量（见图3B），提示Notch1表达能够促进黑素瘤细胞侵袭。划线法结果显示24h，转染组细胞迁移率明显高于对照组（P<0.05）（见图3C），提示Notch1表达能够促进黑素瘤细胞迁移。流式细胞检测结果显示转染组细胞早期凋亡率明显低于对照组（P<0.05）（见图3D），提示Notch1表达能够抑制黑素瘤细胞早期凋亡。
2.4 过表达Notch1对PI3K/AKT信号通路中AKT和p-AKT水平的影响：Notch1水平增加后，AKT蛋白磷酸化水平明显提高（见图4），说明Notch1能够促进PI3K/AKT信号通路的激活。加入了Notch信号通路特异性阻断剂DAPT后，能够有效抑制Notch1过表达引起的AKT蛋白磷酸化的升高，提示Notch1通过调控PI3K/AKT信号通路从而促进黑素瘤细胞发展。
3 讨论
黑素瘤其恶性程度极高，因其发病隐匿且易出现转移，因此治疗棘手[8]。研究发现[9-10]Notch信号通路不仅决定了细胞分化方向，而且在细胞增殖、迁移以及凋亡过程中起着极其重要的作用。Notch1是Notch通路中的四个受体之一，在不同的肿瘤组织中，Notch1蛋白异常活化对细胞代谢、血管生成等起着不同的作用，从而表现出促进或抑制肿瘤的作用。
有文献报道称[11]Notch1参与了黑素细胞的恶变。本研究采用RT-PCR检测Notch1 mRNA在黑素瘤细胞和正常黑素细胞中的表达，结果显示黑素瘤细胞系：MM200、Mel-CV、A2058和A375细胞中Notch1 mRNA水平明显高于正常黑素细胞系HemN-MP（P<0.05），研究结果与国外学者Golan T结果一致，提示Notch1可能与黑素细胞病变为黑素瘤细胞密切相关，并有可能参与了黑素瘤细胞的增殖和侵袭等生物学行为。为了进一步观察Notch1表达对黑素瘤细胞发展过程中的作用，本研究采取慢病毒转染技术构建Notch1过表达的黑素瘤细胞系，结果显示转染组中Notch1蛋白水平和Notch1mRNA水平均明显高于对照组（P<0.05），提示成功构建了Notch1过表达的细胞株。且黑素瘤细胞A2058细胞中Notch1水平升高后，细胞的增值速率显著提高，在48h、72h和96h转染组细胞增殖能力明显高于对照组（P<0.05），提示Notch1表达能够促进黑素瘤细胞增殖。Transwell结果显示Notch1水平升高可以显著增加穿过小室膜A2058细胞数量，提示Notch1表达能够促进黑素瘤细胞侵袭。划线法结果显示24h，转染组细胞迁移率明显高于对照组（P<0.05），提示Notch1表达能够促进黑素瘤细胞迁移。流式细胞检测结果显示转染组细胞早期凋亡率明显低于对照组（P<0.05），提示Notch1表达能够抑制黑素瘤细胞早期凋亡。南方医科大学齐艳霞等[13]采用小分子RNA干扰技术沉默Notch1的表达，转染于小鼠皮下肿瘤中，结果显示沉默Notch1能够明显抑制小鼠肿瘤生长，与本研究结果一致。
PI3K/AKT信号通路是目前研究最为火热的信号通路，其能够通过增加葡萄糖代谢，从而达到促进肿瘤细胞增殖的目的，文献报道称[14]在人类肿瘤组织中PI3K/AKT信号通路均处于激活状态。还有文献称[6]Notch1在胸腺细胞成熟过程中能够维持AKT的活性，本研究结果显示Notch1表达水平上调，能够显著促进AKT的磷酸化，加入Notch特异性阻断剂DAPT后能够有效抑制Notch1過表达引起的AKT蛋白磷酸化的升高，提示Notch1通过调控PI3K/AKT信号通路从而促进黑素瘤细胞发展。
尽管一些生物靶向治疗在一定程度上能够延长生存时间，但是出现转移的黑素瘤尚缺乏有效的治疗手段，本研究证实了Notch1能够调节PI3K/AKT信号通路促进黑素瘤的发展，越来越多文献[15-16]证实Notch异常活化在肿瘤发生过程中起着重要的作用，譬如成神经管细胞瘤和乳腺癌，可经Notch通过阻断剂进行治疗。本研究为临床治疗黑素瘤提供了新的思路。
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[收稿日期]2018-08-29 [修回日期]2018-10-19
编辑/贾敏
本文引用格式：地里夏提·库尔班，陈召.Notch1调控PI3K/AKT信号通路促进黑素瘤细胞发展的研究[J].中国美容医学，2019，28（1）：93-96.