【摘要】 目的：探究中华苦荬菜提取物Chinensiolide A（C15H18O4）对肺腺A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞的抗肿瘤活性。方法：用不同浓度的Chinensiolide A处理体外培养的肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞24 h后，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测Chinensiolide A对该3种细胞生长的影响，计算细胞生长抑制率得出半数抑制浓度（IC50），并观察形态学变化。结果：在1～50 μmol/L浓度范围内，Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞都有较强的抑制率，且随着浓度的增大，抑制作用越强，IC50分别是17.79 µmol/L、25.75 µmol/L、13.6 µmol/L。形态学结果显示，Chinensiolide A对上述3种肿瘤细胞均有不同程度的杀伤作用，其作用随浓度的增加而增强。结论：中华苦荬菜提取物Chinensiolide A在体外可有效的抑制肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及LoVo细胞的生长，具有较强的抗肿瘤活性。
【关键词】 Chinensiolide A； MTT法； 抗肿瘤药； 细胞系； 肿瘤； 体外研究
In Vitro Anti-tumor Activity of Extract Chinensiolide A from the Ixeris Chinensis/ZHOU Li，ZHAO Ying，WANG Yu，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（34）：109-111
【Abstract】 Objective：To explore the antitumor activity of extract Chinensiolide A from the Ixeris chinensis on A549 cells，Ble-7402 cells and LoVo cells.Method：Chinensiolide A was treated with different concentrations of A549 lung adenocarcinoma cells，Ble-7402 liver cancer cells and LoVo cells of colorectal adenocarcinoma after 24 h，the MTT method was used to detect Chinensiolide A influence the three kinds of cell on growth， half inhibitory concentration （IC50） was calculated by cell growth inhibition rate， and the morphological changes were observed.Result：In 1 to 50 µmol/L concentration range， Chinensiolide A on lung adenocarcinoma A549 cell， Ble-7402 cells of liver cancer and colorectal adenocarcinoma LoVo cells had strong inhibition rate， and with the increase of concentration， the stronger the inhibition，the IC50 was respectively 17.79 µmol/L，25.75 µmol/L and 13.6 µmol/L.Conclusion：Chinensiolide A can effectively inhibit the growth on A549 cells， Ble-7402 cells and LoVo cells in vitro ，it has stronger antitumor activity.
【Key words】 Chinensiolide A； MTT assay； Antineplastic drugs； Cell line； Tumor； In vitro study
First-author’s address：School of Basic Medicine，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.34.034
在现代抗肿瘤药物中，中药占据重要的地位，目前从中草药资源中寻找选择性高、活性强、作用独特、毒副作用小的抗肿瘤新药研究方兴未艾[1]。中华苦荬菜又名丝叶苦菜、山苦菜，系菊科被子植物，1～2年生或多年生草本，叶或茎被折断后有白色乳状物流出，全草呈苦味，具有清热、解毒、消炎、凉血、止痛、消肿等功效[2-3]。本研究首次报道了中药中华苦荬菜根部提取物Chinensiolide A（化学结构见图1）在细胞水平上对肺腺癌A549细胞、人肝癌Ble-7402细胞、结直肠腺癌LoVo三种细胞的抑制作用，为该药接下来的临床应用提供科学依据。
图1 Chinensiolide A化学结构
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 中华苦荬菜提取物Chinensiolide A由张树军等[4]合成，纯度≥98%（HPLC），人肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞来自齐齐哈尔医学院基础研究室[5-6]。DMEM培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自hyclone公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司。
1.2 仪器与设备 Safire2多功能酶标仪购自奥地利，洁净操作台购自苏净集团安泰公司，二氧化碳孵箱购自日本三洋公司，Olympus IX70-SIF2倒置显微镜；恒温水浴锅，电子天平购自德国赛多利斯集团，微量移液器购自Gilson公司。
1.3 实验方法
1.3.1 药液配制 精密称取Chinensiolide A 粉末适量，转至1 mL量瓶中，加入DMSO稀释至刻度，充分溶解，使母液浓度为55 mmol/L。取母液10 μL，加入不含血清的培养基990 μL，稀释至550 μmol/L的工作液。过滤除菌后使用，现用现配。取上述工作液10 μL，加至100 μL细胞液中，终浓度为50 μmol/L，确保DMSO的终浓度不超过0.1%。
1.3.2 细胞培养 将肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞分别置于5 mL DMEM培养液的培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，复苏次日及隔日更换培养液，待细胞至对数生长期进行传代，消化液为0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA[7]。实验选择处于对数生长期的细胞进行研究。
1.3.3 MTT法测细胞活性 对数生长期的A549细胞、Ble-7402细胞及LoVo细胞，消化后计数制成细胞悬液，浓度为4×104个/mL，取100 μL接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的Chinensiolide A，加样体积为10 μL/孔，对照孔加DMSO，继续培养24 h，然后每孔加入6 mg/mL的MTT磷酸缓冲液10 μL，同条件下继续培养4 h，弃孔内原有液体，加DMSO 150 μL/孔，振荡以充分溶解结晶，用全自动酶标仪测定570 nm处的吸光度（D值）（参比波长630 nm）。以溶剂对照组细胞存活率为100%，计算不同浓度的Chinensiolide A实验组细胞的存活率和抑制率。计算公式如下：存活率=（Chinensiolide A 实验组D值/对照组D值）×100%；抑制率=100%-存活率。采用计算软件（LOGIT 法）计算Chinensiolide A的半数抑制浓度（IC50）值，每个实验重复3 次。
1.3.4 形态学观察比较法 在加药24 h后，加入MTT 10 μL/孔，继续培养4 h后，利用倒置显微镜观察实验组与对照组细胞，进行形态学观察分析。
1.4 统计学处理 使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，单因素方差分析（one way ANOVA）进行组间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞的影响 在浓度1～50 µmol/L间Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞的抑制作用随浓度的增长而增加，存活率依次降低。在10、20 µmol/L两浓度药物作用下抑制率差距尤为显著，在50 µmol/L时，Chinensiolide A对人肺癌A549细胞活力的抑制率已高达98.37%，提示Chinensiolide A在低浓度对A549细胞也有较强的抑制作用。Chinensiolide A对人肺癌A549细胞IC50值是17.79 µmol/L，见表1。
表1 Chinensiolide A对人肺癌A549细胞活力的抑制作用（x±s）%
组别存活率抑制率
空白对照组99.99±5.06 0.01±5.06
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L99.57±2.22 0.43±2.22
10 μmol/L89.32±3.53*10.68±3.53*
20 μmol/L59.85±3.32*40.15±3.32*
30 μmol/L30.99±3.67*69.01±3.67*
40 μmol/L24.46±2.80*75.54±2.80*
50 μmol/L1.63±0.45*98.37±0.45*
*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol·L-1Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01
2.2 Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的影响 在浓度1～50 µmol/L浓度范围内，Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的抑制率由0.68%升至85.27%，抑制作用随药物浓度的增加而增长，且各浓度组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），其浓度依赖关系显著。Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的IC50值为25.75 µmol/L，见表2。
表2 Chinensiolide A对人肺癌BEL-7402细胞活力的
抑制作用（x±s） %
组别存活率抑制率
空白对照组99.99±1.99 0.01±1.99
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L99.32±1.18 0.68±1.18
10 μmol/L84.15±3.53*15.85±3.53*
20 μmol/L67.27±2.37*32.73±2.37*
30 μmol/L52.83±2.64*47.17±2.64*
40 μmol/L34.33±5.04*66.67±5.04*
50 μmol/L14.73±3.22*85.27±3.22*
*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol/L Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01
2.3 Chinensiolide A对结直肠腺癌LoVo细胞的影响 在浓度1～50 µmol/L浓度范围内，Chinensiolide A对结直肠腺癌LoVo细胞的抑制作用随浓度的增长而增加，抑制作用由1.12%增至99.57%，接近于全部抑制；且各组之间抑制率变化幅度较大，尤其在浓度1、10 µmol/L浓度和40、50µmol/L浓度之间变化近30个百分点，说明其抑制作用呈现出一定的浓度依赖趋势。Chinensiolide A对结直肠腺癌LoVo细胞的IC50值为13.6 µmol/L，见表3。
表3 Chinensiolide A对人肺癌LoVo细胞活力的抑制作用（x±s）%
组别存活率抑制率
空白对照组99.99±1.79 0.01±1.79
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L98.88±2.95 1.12±2.95
10 μmol/L70.65±4.71*29.35±4.71*
20 μmol/L55.39±6.29*44.61±6.29*
30 μmol/L43.92±2.96*56.08±2.96*
40 μmol/L24.61±3.84*75.39±3.84*
50 μmol/L 0.43±0.65*99.57±0.65*
*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol·L-1Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01
2.4 形态学观察 结果显示空白组细胞贴壁正常生长、分裂，呈不规则形状，部分细胞中有多个细胞核且细胞核较大，颜色较深，细胞之间紧密排列，生长状态良好。药物组细胞生长缓慢，部分细胞死亡，药物对3种肿瘤细胞的生长有不同程度的杀伤作用，对每种肿瘤细胞的抑制作用随浓度的增加作用增强。加入MTT后，能清楚看出存活的细胞，与空白对照组相比，Chinensiolide A的浓度在50μmol/L时，对3种细胞系抑制作用最强。
3 讨论
如今肿瘤俨然成为21世纪一大难题，关于治疗肿瘤疾病的课题也成为世界大热点，中药具有多环节、多靶点抗肿瘤的作用，并且毒性小，副作用低，源于自然，药源丰富，国内外对单味中药提取物抗肿瘤作用进行了广泛而深入的研究[8-13]。中华苦荬菜具有多方面的生物活性，包括抗炎、抗烟碱、抗氧化、抗病毒、抗白血病等，其根部提取物Chinensiolide A为愈创木烷型倍半萜内酯类化合物[14-15]。本实验通过研究Chinensiolide A在3种人源肿瘤细胞系——人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人结直肠腺癌LoVo细胞的抗肿瘤活性，首次探究出其较强的抗肿瘤活性。
本课题组经过在药物浓度1～1000 µmol/L范围内的初步研究，发现Chinensiolide A对三种肿瘤细胞系均有不同程度的抑制作用，且作用显著。在预实验中，Chinensiolide A浓度大于50 µmol/L时，细胞存活率均小于10%，随着浓度的增加存活率明显下降，发现该药对三种细胞均有不同程度的抑制作用，且作用比较明显，从而根据数据设计，将浓度确定在1～50 µmol/L准确测量，来获得准确的IC50数值。结果显示中华苦荬菜提取物Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞、肝癌Bel-7402细胞、结直肠腺癌LoVo细胞有明显抑制作用，IC50分别是17.79 µmol/L、25.75 µmol/L、13.6 µmol/L。
综上所述，中华苦荬菜提取物Chinensiolide A具有一定的抗肿瘤活性，在对三种细胞系的实验中，Chinensiolide A对A549细胞、LoVo细胞的抑制作用要较对Bel-7402细胞显著。因此，Chinensiolide A在抗肿瘤方面具有很好的发展前景，值得深入探究，在接下来的研究中，可以通过抗肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞周期阻滞、凋亡、分化，肿瘤免疫以及动物水平等各种研究方法来更精确地了解抗肿瘤机制。
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（收稿日期：2015-07-11） （本文编辑：周亚杰）