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[摘要] 目的 探讨结肠癌及癌前病变中增殖诱导配体（APRIL）和caspase-3蛋白的表达及其作用机制。 方法 收集2009年8月～2015年4月东莞市石碣医院和广州市暨南大学附属一院病理科结肠癌切除及结肠镜活检标本共190例，其中正常结肠黏膜25例，结肠腺瘤伴轻、中、重度不典型增生各25例，结肠癌40例。采用SP法免疫组化方法检测各组黏膜中APRIL和caspase-3蛋白表达情况。 结果 在正常结肠黏膜、结肠腺瘤伴轻度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和结肠癌中，APRIL的表达呈逐渐增高趋势，caspase-3的表达呈递减趋势，差异有统计学意义（χ2=21.49、12.79，P < 0.05）。APRIL的阳性表达与结肠癌患者的组织分化、淋巴结转移以及浸润程度有关（P < 0.05），而caspase-3的阳性表达与结肠癌患者的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期、淋巴结转移有关（P < 0.05）。经Spearman等级相关分析，40例结肠癌中APRIL和caspase-3表达呈明显的负相关性（r=-0.512，P < 0.05）。 结论 APRIL的过表达和caspase-3的表达下降可能在结肠癌的发生发展过程中发挥重要作用，两者表达具有一定相关性。
[关键词] 结肠癌；结肠癌前病变；APRIL；caspase-3
[中图分类号] R735.3+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）05（b）-0092-04
[Abstract] Objective To observe the expressions of APRIL and caspase-3 in colon carcinoma and colon precancerous lesion， and to study the role of APRIL and caspase-3. Methods 190 cases of colon cancer resection and colonoscopy biopsy specimens in General Department of Dongguan Shijie Hospital and the First Hospital of Jinan University from August 2009 to April 2015 were collected， including 25 cases of normal colon mucosa， 75 cases of colon precancerous lesion and 40 cases of colon carcinoma. The immune histochemical staining was used to detect the expressions of APRIL and caspase-3 in 25 cases of normal colon mucosa， 75 cases of colon precancerous lesion and 40 cases of coloncarcinoma. Results The expression of APRIL increased from normal colon mucosa， colon adenoma with mild dysplasia， with moderate dysplasia， with severe dysplasia to colon gastric carcinoma （χ2=21.49， P < 0.05） and the expression of caspase-3 decreased from normal colon mucosa， colon adenoma with mild dysplasia， with moderate dysplasia， with severe dysplasia to colon carcinoma （χ2=12.79， P < 0.05）. The positive expression of APRIL were related to tissue differentiation， lymph node metastasis and the depth of invasion. The positive expression of caspase-3 were related to TNM stage and lymph node metastasis. The expression rate of APRIL was negatively correlated with the expression rate of caspase-3 （r=-0.512， P < 0.05）. Conclusion The over-expression APRIL and the lose-expression caspase-3 may play the important role in the development of colon carcinoma and it"s negative relationship between APRIL and caspase-3.
[Key words] Colon carcinoma； Colon precancerous lesions； APRIL； Caspase-3
近年调查研究发现，细胞的增殖和凋亡平衡紊乱在结肠癌的发生、发展过程中发挥了十分重要的作用[1-3]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族参与了凋亡的调控过程，其中caspase-3是caspase家族中参与细胞凋亡调控的关键蛋白酶[4-5]。增殖诱导配体（APRIL）是肿瘤坏死因子（TNF）超家族的新成员，对促进细胞的增殖、分化和细胞转移具有重要的作用，在结肠、食管、结肠等消化道恶性肿瘤中均发现高表达[6-7]。本研究采用免疫组化SP法检测结肠癌及癌前病变中APRIL和caspase-3蛋白的表达并探讨其与临床病理因素的关系，进一步阐明它们在结肠癌发生、发展过程中的作用及其分子机制。
1 材料与方法
1.1 一般材料
收集2009年8月～2015年4月东莞市石碣医院和广州市暨南大学附属一院病理科的手术切除或结肠镜活检切除标本，其中正常结肠黏膜25例，结肠腺瘤伴轻、中、重度不典型增生组织各25例，结肠癌40例。所有标本均经病理学诊断证实。
1.2 方法
采用免疫组化SP法检测APRIL和caspase-3的表达。caspase-3山羊抗人多克隆抗体（工作浓度1∶50）均购自美国cell signal公司，单克隆抗体APRIL购自Abcam公司。SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，严格按照试剂盒的操作程序说明进行操作步骤。染色结果判断：caspase-3定位于肿瘤细胞胞浆和胞膜内，APRIL表达于肿瘤细胞胞浆或者胞膜，呈黄色或棕黄色颗粒状。以每张切片的表达阳性肿瘤细胞的染色强度和阳性细胞率计分之和进行判定结果。染色强度：无色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；阳性细胞率：≤5%计0分；6%～25%记1 分；26%～50%记2 分；51%～100%记3 分。将两项评分相加，≤1分为（-），2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.00统计软件进行统计学分析，率的比较用χ2检验或精确概率法检验，两者相关性用非参数Spearman等级相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 APRIL和caspase-3蛋白在各种结肠黏膜病变中的表达
在正常结肠黏膜、结肠腺瘤伴轻度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和结肠癌中，APRIL的表达呈逐渐增高趋势，caspase-3的表达呈递减趋势，差异有统计学意义（χ2=21.49、12.79，P < 0.05）。见表1、图1～2。
2.2 结肠癌中APRIL和caspase-3的表达与临床病理特征的关系
APRIL的阳性表达与结肠癌患者的组织分化、淋巴结转移以及浸润程度有关（P < 0.05），组织分级高、有淋巴结转移者、浸润浆膜层及以外者的APRIL表达明显高于组织分级低、无淋巴结转移者和浸润黏膜层或黏膜下层者（P < 0.05），而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移（TNM）分期无关（P > 0.05）。
caspase-3的阳性表达与结肠癌患者的TNM分期、淋巴结转移有关（P < 0.05），TNM分期Ⅰ～Ⅱ级、无淋巴结转移者的caspase-3表达明显高于TNM分期Ⅲ～Ⅳ级、有淋巴结转移者 （P < 0.05），而与年龄、性别、肿瘤大小、组织分化及浸润深度无关（P > 0.05）。见表2。
2.3 结肠癌中APRIL和caspase-3表达的相关性
经Spearman等级相关分析，40例结肠癌中APRIL和caspase-3表达呈明显的负相关性（r=-0.512，P < 0.05）。
3 讨论
细胞增殖与凋亡是肿瘤发生、发展过程中的一对矛盾，两者间的动态平衡状况与肿瘤的发生、发展及浸润转移等生物学行为密切相关。结直肠黏膜上皮细胞增殖和凋亡在正常生理状况下处于相对平衡而不断更新的状态，以保证其结构和功能的完整性。一旦这种平衡被打破，组织结构即受到破坏或肿瘤形成[8-9]。因此关于肿瘤细胞的凋亡及其调节机制的研究已经成为目前人们关注的热点之一[10-11]。
APRIL基因编码定位于染色体17p13.1，具有促进肿瘤细胞的增殖、调节体液免疫等功能[12-13]。APRIL在正常组织中基本不表达或者弱表达，但其在结直肠癌细胞系、淋巴瘤细胞系、黑色素瘤细胞系等中表达异常增高[14-15]。毛振彪等[16]检测了APRIL在结肠黏膜癌变过程中表达情况，结果显示异性增生结肠黏膜组织以及结肠癌组织中能检测到APRIL的高表达，而正常结肠黏膜组织中APRIL表达下降，提示APRIL在结肠黏膜癌变过程中呈累积和渐进的现象，但其具体作用机制仍在研究初期阶段。本研究结果显示，APRIL在正常结肠黏膜、结肠腺瘤伴轻度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和结肠癌中的表达呈逐渐增高趋势（P < 0.05）。提示APRIL在结肠癌演变过程中占据重要位置，结肠癌前病变阶段就已经存在APRIL高表达的现象，而在结肠癌中其表达更是进一步增高，推测APRIL异常表达可能是结肠癌发生的早期事件，有可能成为结肠癌早期诊断的新分子学指标。本研究进一步发现，APRIL的阳性表达与结肠癌患者的组织分化、淋巴结转移以及浸润程度有关（P < 0.05），说明在结肠癌的进展过程中，随着组织分化变差、淋巴结发生转移以及浸润浆膜层，APRIL蛋白表达逐渐增强，提示APRIL蛋白的异常表达能促进癌细胞的恶性分化，并提高其浸润和侵袭能力，利于癌细胞转移淋巴结以及侵润浆膜层及以外。因此，检测APRIL的表达将有助于预测结肠癌浸润转移的发生，对减缓结肠癌的病情进展具有一定的临床指导意义。
Caspase家族是调节细胞凋亡过程中的关键分子，其中Caspase-3是该家族中最关键的凋亡效应执行分子，其表达缺失或下降可能导致细胞增殖和凋亡平衡的紊乱，致使细胞异常增生甚至恶性转化[17-18]。本研究结果发现，caspase-3在正常结肠黏膜、结肠腺瘤伴轻度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和结肠癌中的表达呈递减趋势（P < 0.05）。提示caspase-3表达下降与结肠癌的发生密切相关，且可能出现于结肠腺上皮细胞的早期异常增殖，并具有促进其恶性转化的作用。同时本研究结果还发现caspase-3的阳性表达与结肠癌患者的TNM分期、淋巴结转移有关（P < 0.05）。提示caspase-3表达的缺失可能促进了结肠癌的病情进展，且与癌组织的淋巴结转移有关，可成为预测结肠癌淋巴结转移的参考指标。caspase-3表达下降或缺失，致使癌细胞逃避凋亡，增生能力增强，癌细胞进一步发展、转移、侵袭。因此深入探讨Caspase-3的凋亡调控机制，将可能为人们提供新的基因治疗靶点[19-20]。
本研究对结肠癌组织中APRIL和caspase-3表达的相关性进行了分析，结果显示40例结肠癌中APRIL和caspase-3表达呈明显的负相关性（r=-0.512，P < 0.05）。说明两者不仅均参与了结肠癌的发生进展过程，且两者发挥的作用具有一定相关性。推测APRIL能上调X相联系的凋亡蛋白抑制因子（XIAP）的表达，而XIAP是caspase家族的抑制物，能降低caspase-3活性，进而通过抑制caspase-3表达和活性而发挥抗凋亡作用，但两者之间相互作用的具体机制仍不明确。
[参考文献]
[1] 端传友.MMP-2、MMP-9及VEGF在结肠癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性[J].中国医药导报，2012，6（21）：50-51.
[2] 唐道爱.细胞增殖和凋亡与结直肠癌的发生发展[J].医学综述，2011，l7（9）：1321-1323.
[3] Ramakrishnan G，Lo Muzio L，Elinos-Báez CM，et al. Silymarin inhibited proliferation and induced apoptosis in hepatic cancer cells [J]. CellProlif，2009，42（2）：229-240.
[4] 樊勇军，冯一中，李海，等.Survivin、caspase及AKT1在大肠癌中的表达及意义[J].实用癌症杂志，2010，25（1）：26-33.
[5] 刘继洪，潘月龙，姚航平.小白菊内酯诱导结肠癌细胞凋亡及对Caspase-3，Caspase-9表达的影响[J].中国药物与临床，2009，9（8）：701-703.
[6] 张冬雷，施健，王惠民，等.APRIL及其受体在结直肠癌变过程中表达水平的改变[J].肿瘤，2005，25（6）：577—580.
[7] Ding W，Wang J，Sun B，et al. APRIL knockdown suppresses migration and invasion of human colon carcinoma cells [J]. Clin Biochem，2009，42（16-17）：1694-1698.
[8] 袁德汉，康举龄，苏艳桃，等.APRIL和XIAP在结肠癌、结肠腺瘤及正常结肠黏膜中的表达及意义[J].中国当代医药，2014，9（25）：18-20.
[9] 魏国丽，周宇.原花青素对结肠癌HT-29细胞凋亡及Survivin、Caspase-3和Stat3基因mRNA的影响[J].广东医学院学报，2015，6（3）：14-16.
[10] 董晓彤，黄莹，李巍，等.Caspase3、Bcl-2的表达在结肠癌诊断中的临床意义[J].世界华人消化杂志2013，10（30）：106-110.
[11] 关婧，孙爱民，王莉慧，等.慢病毒介导RNAi抑制大肠癌细胞APRIL表达对化疗敏感性的影响[J].南方医科大学学报，2011，8（9）：138-142.
[12] 张伟兴，潘耀东，汪美华.大肠癌组织Survivin和APRIL表达临床意义探讨[J].中华肿瘤防治杂志，2014，10（19）：45-48.
[13] 郭云蔚，文卓夫，郑丰平，等.APRIL在大肠癌组织中的表达及化疗药物对大肠癌SW480细胞APRIL表达的影响[J].癌症，2008，4（4）：39-43.
[14] Kimberley FC，Medema JP，Hahne M. APRIL in B-cell malignancies and autoimmunity [J]. Results Probl Cell Differ，2009，49：161-182.
[15] Migita K，Ilyassova B，Kovzel EF，et al. Serum BAFF and APRIL levels in Datients with PBC [J]. Clin Immunol，2010，134（2）：217-225.
[16] 毛振彪，张冬雷，施健，等.胃黏膜癌变过程中增殖诱导配体及其受体表达水平分析[J].中华消化杂志，2005， 25（8）：476-479.
[17] 黄永平，何健，郭婷.鼻咽癌组织中XIAP和caspase-3的表达及意义[J].中国现代药物应用，2011，5（12）：47-48.
[18] 常方芝，田字彬.FHIT，Caspase-3及Survivin蛋白在结肠癌组织中的表达及其意义[J].大连医科大学学报，2011， 8（4）：71-73.
[19] 李鸿飞，唐卫中，黄庆录，等.奥沙利铂对二甲肼诱导的结肠癌大鼠CD44V6、VEGF、survivin、Caspase-3和Caspase-7的影响[J].肿瘤防治研究，2015，6（6）：31-34.
[20] 申炜，翟振丽，马维红.结肠癌术后辅助化疗对血Caspase-3、Survivin、CD44v6表达的影响[J].广西医学，2014， 10（12）：92-94.
（收稿日期：2016-01-21 本文编辑：赵鲁枫）