打开文本图片集
摘 要：探索通过接种乳酸菌对鲍鱼进行发酵，抑制发酵过程有害杂菌生长，降低发酵鲍鱼产品中的亚硝酸盐含量，提高鲍鱼品质和食用安全性。通过单因素试验研究菌种配比、乳酸菌接种量、发酵温度及发酵时间对发酵鲍鱼氨基酸态氮含量及亚硝酸盐含量的影响，以氨基酸态氮含量和亚硝酸盐含量为主要指标，应用响应面回归分析（RSM），得出乳酸菌接种量、发酵温度和发酵时间影响氨基酸态氮含量及亚硝酸盐含量变化趋势的二次模型方程，在此基础上，优化得到最佳发酵工艺条件。结果表明：鲍鱼发酵的最佳工艺条件为乳酸菌接种量1.78%、发酵温度34.5℃、发酵时间27.2 h。在此发酵条件下，发酵鲍鱼氨基酸态氮含量62.29 mg·kg-1，预测值62.35 mg·kg-1;亚硝酸盐含量0.48 mg·kg-1，预测值0.47 mg·kg-1，预测值与实测值基本相符。
关键词：乳酸菌;鲍鱼;发酵工艺;响应面法
Abstract：Through inoculating lactic acid bacteria to ferment abalone， the study was explored to inhibit the growth of harmful bacteria in fermentation process， reduce the content of nitrite in fermented abalone products， and improve the quality and food safety of abalones. The single factor experiment was conducted to study the effects of bacteria ratio， inoculation amount of lactic acid bacteria， fermentation temperature and fermentation time on amino nitrogen content and nitrite content of fermented abalones.With the amino nitrogen content and nitrite content as the main indexes，the response surface method （RSM） was used to obtain the quadratic model equation of variation trend of the amino acid nitrogen content and nitrite content that was affected by the inoculation amount of lactic acid bacteria， fermentation temperature and fermentation time. On this basis， the optimal fermentation technology conditions were optimized. The results showed that the optimum conditions for abalone fermentation were 1.78% lactobacillus inoculation， 34.5℃ fermentation temperature and 27.2 h fermentation time. Under this fermentation condition， the amino acid nitrogen content of fermented abalone was 62.29 mg·kg-1， and the predicted value was 62.35 mg·kg-1. The content of nitrite was 0.48 mg·kg-1， and the predicted value was 0.47 mg·kg-1， which was basically consistent with the measured value.
Key words：Lactic acid bacteria; Abalone; Fermentation process; Response surface method
鲍鱼是中国传统的名贵食材，其肉质细嫩、鲜味浓郁，位列八大“海珍”之一，是极为珍贵的海产品。鲍鱼深加工是水產研究的热点问题。世界各地都有盐渍鲍鱼的饮食习惯，但鲍鱼在盐渍时会丢失很多营养物质，且传统盐渍发酵过程中各种不确定因素导致有害杂菌生长，发酵过程产生亚硝酸盐等有害物质，影响食用安全性。密更等[1]研究了常见发酵鱼制品中优势乳酸菌种类，得出糟鱼、酸鱼中的优势乳酸菌为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、戊糖乳杆菌及戊糖片球菌等;王悦齐等[2]研究干酪乳杆菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌的混合发酵剂发酵后带鱼的脂质抗氧化活性，发现乳酸菌对成品的不饱和脂肪酸的氧化有明显的抑制作用。刘玉等[3]研究降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选及其在发酵鱼糜中的初步应用，筛选获得3株具有较高降解亚硝酸盐能力的乳酸菌。张弦[4]研究了复合乳酸菌发酵剂对鱼肉香肠品质的影响，试验结果表明发酵过程中鱼肉香肠的TVBN含量、TBA值和亚硝酸盐含量显著降低，氨基态氮含量显著升高。柳念等[5]研究总结纯种乳酸菌发酵比自然发酵生成的亚硝酸盐含量低，乳酸菌能够高效地降解亚硝酸盐。许女等[6]筛选出高效降解亚硝酸盐和生物胺活性的植物乳，并将其应用在鱼肉发酵香肠中，产品在成熟期间亚硝酸盐的残留量和挥发性盐基氮的含量均有明显降低。为了解决传统盐渍鲍鱼发酵过程中杂菌生长，亚硝酸盐含量高的问题，本研究探索通过接种乳酸菌进行人工发酵加工半干鲍鱼，抑制杂菌生长，降低盐渍鲍鱼产品中的亚硝酸盐含量，在发酵过程中，鲍鱼中的蛋白质分解为小分子氨基酸、肽，增加了产品的风味和营养，提高盐渍鲍鱼的品质和食用安全性。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试验材料 鲍鱼、植物乳杆菌、戊糖片球菌、食盐。
1.1.2 试验仪器 FA2104电子天平（上海方瑞仪器有限公司）;TE313SDS电子分析天平（德国赛多利斯集团）;DHG9023A电热恒温鼓风烘箱（上海申贤恒温设备厂）;SWCJ2DD单人双面净化工作台（常州诺基仪器有限公司）;37XEPC生物显微镜（上海光学仪器厂）;JLQS1菌落计数器（精艺兴业科技有限公司）;UV759CRT紫外可见分光光度计（上海佑科仪器公司）;S20K酸度计（梅特勒托利多集团）;DHG9123A高压灭菌锅（上海申安集团）;SHP2500生化培养箱（上海精宏有限公司）。
1.2 工艺流程及说明
1.2.1 工艺流程 原料→预处理→清洗→减菌化处理→接种发酵→真空包装→蒸煮→冷却冷藏→成品
1.2.2 工艺说明 （1）预处理：新鲜鲍鱼经去壳、去除内脏后进行清洗。（2）清洗：用盐度2%～3%，温度为0～7℃的冰盐水进行清洗，清洗3次，将内脏残留物全部挤出清洗干净。（3）减菌化处理：将清洗后的鲍鱼，放入臭氧水中进行浸泡减菌化处理。（4）发酵：将减菌化处理的鲍鱼与6%食盐及2%葡萄糖放入灭菌容器中，按比例接种发酵剂混匀后，置于适宜温度下密封发酵。（5）真空包装：对发酵腌制后的鲍鱼制品立即进行真空包装;（6）蒸煮：将真空包装后的鲍鱼立即放入蒸煮锅内蒸煮，蒸煮温度≥95℃，时间≥45 min。（7）冷却：将蒸煮后的产品放入0℃左右冷却水降温30 min以上。（8）冷藏：将冷却后的鲍鱼在0～3℃下储藏。
1.3 试验设计
1.3.1 单因素试验 （1）菌种配比对鲍鱼发酵的影响。在加盐量为6%，乳酸菌接种量为1.0%、发酵温度为30℃、发酵时间为12 h的条件下，植物乳杆菌与戊糖片球菌的菌种配比分别取3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3进行鲍鱼盐渍发酵试验，研究菌种配比对鲍鱼发酵的影响。（2）乳酸菌接种量对鲍鱼发酵的影响。在加盐量为6%，菌种配比为1∶1、发酵温度为30℃、发酵时间为12 h的条件下，乳酸菌接种量分别取0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%进行鲍鱼发酵试验，研究乳酸菌接种量对鲍鱼发酵的影响。（3）发酵温度对鮑鱼发酵的影响。在菌种配比为1∶1、乳酸菌接种量为1.0%、发酵时间为24 h的条件下，发酵温度分别取15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃进行发酵试验，研究发酵温度对鲍鱼发酵的影响。（4）发酵时间对鲍鱼发酵的影响。在菌种配比为1∶1、乳酸菌接种量为1.0%、发酵温度为30℃的条件下，发酵时间分别取12、16、20、24、28、32 h进行鲍鱼发酵试验，研究发酵时间对鲍鱼发酵的影响。
1.3.2 响应面试验设计 采用三因素三水平二次回归正交旋转组合设计，以乳酸菌接种量、发酵温度及发酵时间为因素，以氨基酸态氮含量及亚硝酸盐含量为响应值，进行响应面分析试验。响应面试验设计与因素水平编码见表1。
1.4 指标的测定
1.4.1 氨基酸态氮含量的测定 参照文献[7]，采用双指示剂甲醛滴定法进行测定。
1.4.2 亚硝酸盐含量的测定 参考《GB 5009.33-2010 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[8]，采用盐酸萘乙二胺法进行测定。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 菌种配比对鲍鱼发酵的影响 由图1可知，当植物乳杆菌、戊糖片球菌的菌种配比为1∶2时，氨基酸态氮含量达到最高，而亚硝酸盐含量降到最低，可能此配比下两株乳酸菌之间的协同发酵作用最佳。因此，选择植物乳杆菌、戊糖片球菌的菌种配比为1∶2。
2.1.2 乳酸菌接种量对鲍鱼发酵的影响 由图2可知，接种量从0增加至1.5%时，发酵鲍鱼的氨基酸态氮含量逐渐上升，而亚硝酸盐含量逐渐下降。乳酸菌接种量增加，有利于乳酸菌定殖成为优势菌，乳酸菌代谢生成的酶类促进蛋白质降解，乳酸发酵产酸有利于鲍鱼内源酸性蛋白酶对蛋白质的降解[9]。乳酸与亚硝酸盐结合生成游离亚硝酸，分解生成NO，乳酸菌将NO2-降解还原成NH4+，NH4+可被乳酸菌利用，合成有机含氮化合物[10-11]，乳酸发酵抑制了杂菌增殖，减少了杂菌的胺化和硝化作用生成亚硝酸盐[12]。当接种量超过1.5%后，亚硝酸盐含量的降低趋于平缓。综合分析，本试验选择乳酸菌接种量1.5%～2.0%为优化试验的水平范围。
2.1.3 发酵温度对鲍鱼发酵的影响 由图3可知，发酵温度由15℃升高到30℃时，鲍鱼的氨基酸态氮含量逐渐增加，亚硝酸盐含量逐渐降低。当发酵温度在30～35℃范围内时，氨基酸态氮含量维持在较高水平，亚硝酸盐含量达到较低值。因此选择优化的发酵温度范围为30～35℃。
2.1.4 发酵时间对鲍鱼发酵的影响 由图4结果可以看出，当发酵时间由12 h延长至28 h时，鲍鱼的氨基酸态氮含量逐渐增加，亚硝酸盐含量逐步下降。但当发酵时间在24～32 h，氨基酸态氮含量和亚硝酸盐含量变化幅度不大，因此选择优化的发酵时间范围为24～28 h。
2.2 响应面RSM分析及工艺参数优化
2.2.1 响应面设计及结果 采用三因素三水平二次回归正交旋转组合设计，以接种量、发酵温度及发酵时间为因素，以氨基酸态氮含量及亚硝酸盐含量为响应值，进行响应面分析试验。
2.2.2 数学回归模型的建立 运用国际权威的SASVersion8.1数据处理软件对响应面回归（RSREG）过程进行数据的拟合分析[13]，根据回归方程Y=a0+ΣaiXi+ΣaijXiXj+ΣXii2建立了接种量（X1）、发酵温度（X2）和发酵时间（X3）影响氨基酸态氮含量（Y1）及亚硝酸盐含量（Y2）变化趋势的二次响应数学模型：
对氨基酸态氮Y1的模型方程进行失拟和回归F检验，结果表明：F失拟=3.180.90，校正决定系数R2=0.9373>0.90，模型方程拟合程度高。
对亚硝酸盐含量Y2的模型方程进行失拟和回归F检验，结果表明：F失拟=2.160.90，校正决定系数R2=0.9840>0.90，模型方程与响应值之间具有高度拟合性;综上所述，数据模型拟合状况良好，试验误差小，可以用来对Y1（氨基酸态氮含量）和Y2（亚硝酸盐含量）进行分析预测。
2.2.3 因子主次效应分析 通过对Y1回归模型的各试验因子系数进行显著性检验，结果表明：X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X2及X2X3的回归系数均呈显著水平，仅X1X3项影响不显著，剔除不显著项，简化Y1回归模型方程为：
Y1=61.089-0.486095X1-1.481128X2+2.74912X3-2.788139X12+0.63875X1X2-0.882483X22 +0.63625X2X3-2.199473X32
通过对Y2回归模型的各试验因子系数进行显著性检验，结果表明：X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X3及X2X3的回归系数均呈显著水平，仅X1X2项影响不显著，剔除不显著项，简化Y2回归模型方程为：
Y2=0.569975+0.02889X1+0.103976X2-0.18988X3+0.177014X12-0.035X1X3+0.05327X22-0.0425X2X3+0.129284X32
2.2.4 因子交互效应分析 将模型方程一个因素固定于零水平，应用SAS软件按照所得的二元二次回归模型方程对其余因素进行分析运算，得到关于两因素交互作用的响应曲面分析立体图。
2.2.5 发酵条件的优化及验证 （1）氨基酸态氮含量最优条件。根据回归模型构建数据库，利用RSREG程序获得氨基酸态氮含量响应值的稳定点。（2）亚硝酸盐含量最优条件。根据回归模型构建数据库，利用RSREG 程序获得亚硝酸盐含量响应值的稳定点。
氨基酸态氮含量与亚硝酸盐含量的编码最优水平差距为：△X1=0.043745、△X2=-0.02439、△X3=0.053715，未編码最优水平差距为：△X1=0.073579、△X2=-0.04103、△X3=0.090348，这表明发酵过程中，氨基酸态氮含量与亚硝酸盐含量的最优工艺条件契合度很高，综合两个指标，并结合实际情况考虑，最后确定鲍鱼接种乳酸菌发酵的工艺条件为：接种量1.78%、发酵温度34.5℃、发酵时间27.2 h。在此发酵条件下，发酵鲍鱼氨基酸态氮含量62.29 mg·kg-1，预测值62.35 mg·kg-1;亚硝酸盐含量0.48 mg·kg-1，预测值0.47 mg·kg-1，预测值与实测值基本相符，验证了模型分析的可靠性，说明优化后的鲍鱼发酵工艺合理可行。
3 结论
通过接种乳酸菌对鲍鱼进行发酵，能够有效抑制鲍鱼发酵过程有害杂菌生长，降低发酵鲍鱼产品中的亚硝酸盐含量，提高鲍鱼品质和食用安全性。本试验通过单因素试验及响应面回归分析，以氨基酸态氮含量和亚硝酸盐含量为主要指标，优化得到鲍鱼最佳发酵工艺条件为乳酸菌接种量1.78 %、发酵温度34.5℃、发酵时间27.2 h。进一步验证试验，数据基本吻合，也就是本试验范围内建立的模型准确有效，可用来预测鲍鱼发酵工艺参数，得到的发酵鲍鱼营养丰富，口感和风味俱佳，具有很好的开发应用前景。
参考文献：
[1]密更，李婷婷，仪淑敏，等.人工接种乳酸菌发酵鱼糜的研究进展[J].中国食品学报，2019，19（5）：302-311.
[2]王悦齐，吴燕燕，李来好，等.抗氧化乳酸菌对发酵腌干带鱼脂肪氧化的影响及其主成分分析[J].食品科学，2017，38（8）：231-238.
[3]刘玉，郑心茹，林伟言，等.降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选及其在发酵鱼糜中的初步应用[J].中国酿造，2019，38（2）：66-72.
[4]张弦.复合乳酸菌发酵鱼肉香肠的工艺及品质研究[D]. 厦门：集美大学，2016.
[5]柳念，陈佩，高冰，等.乳酸菌降解亚硝酸盐的研究进展[J]. 食品科学，2017，38（7）：290-295.
[6]许女，李田田，贾瑞娟，等.降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果[J]. 农业工程学报，2018，34（15）：304-312.
[7]穆华荣.食品检验技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
[8]中华人民共和国卫生部.GB5009.33-2010食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S].北京：中国标准出版社， 2010.
[9]霍贵成.乳酸菌的研究与应用[M].北京：中国轻工业出版，2007.
[10]张庆芳，迟乃玉，郑燕，等.乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究[J].食品与发酵工业，2002（8）：27-31.
[11]唐爱明.乳酸菌降解肉制品中亚硝酸盐机理及菌株筛选研究[D].长沙：湖南农业大学，2004.
[12]谢诚，刘忠义，周宇峰，等.混合菌种发酵对草鱼肉微生物和生物胺变化的影响[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2010（3）：167-172.
[13]高惠璇.实用统计方法与SAS系统[M].北京：北京大学出版社，2001.
（责任编辑：柯文辉）