【摘要】 肿瘤是目前严重影响人类健康的疾病之一，传统的检查方法难以从分子水平早期诊断肿瘤。光学分子成像技术是一种采用光学成像，通过分子荧光标记靶向目标，形成光学分子影像进行肿瘤早期非侵入诊断的方法。光学分子探针是光学分子成像技术的核心，如何设计出具有靶向性和高度亲和力的理想探针成为当今研究的热点。同时随着新型成像仪器的开发和光学分子探针的不断发展，光学成像技术将不断完善，成为临床分子水平早期诊断肿瘤的重要方法。
【关键词】 光学分子成像； 分子探针； 分子探针设计
1 概述
肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一，虽然随着科技的进步，现代医学对肿瘤的诊断水平不断提高，但是肿瘤患者的5年生存率和生活质量仍不太理想，其中最重要的原因之一是缺乏从分子水平获得早期肿瘤诊断信息的方法。目前，临床上对肿瘤的诊断主要依赖于临床症状、血清学检查、常规影像学检测等方法，如X线、X线计算机断层摄影（CT）、放射性核素显像、磁共振成像（MRI）和超声诊断（US），但是肿瘤发病的早期症状隐匿，血清学检测特异性较差，常规的影像学检查手段虽然有许多优点，但从分子水平进行早期诊断还存在许多不足之处，因此，如何从分子水平对肿瘤的发生发展进行早期诊断就成为目前研究的热点。
最新研究表明，光学分子成像技术（Optical Molecular Imaging）将成为未来诊疗技术发展的新方向，是继传统的分子成像方式之后，又一新的影像技术，将成为临床医生的好助手。其原理是利用生物发光、荧光蛋白或荧光染料，标记在体生命大分子，进行定性和定量研究，与磁共振、核素成像等技术相比，具有无创性、高敏感性、成像价格低、特异性强等优点[1]。光学分子成像技术主要分为以下几大类：荧光成像（Fluorescence Imaging，FMI）、生物发光成像（Bioluminescence Imaging，BLI），拉曼成像（Raman Imaging，RI），光声成像（Photoacoustic Imaging，PAI），活体显微镜（Intravital Microscopy，IVM）和光频域成像等（Optical Frequency Domain Imaging，OFDI），其中目前应用最为广泛的是FMI和BLI[2]。
光学分子探针是光学分子成像技术的核心理论和方法，是进行分子影像学研究的先决条件。广义的分子探针是指能在机体内某些部位聚集，并产生影像学信号可供体外设备检测的物质。理想的分子探针具有的生物学特性有[3]：（1）与靶向分子有高特异性和亲和力；（2）分子量较小，容易穿过机体内的生理屏障，并能反映体内靶向分子的数量及空间分布；（3）无毒副作用及免疫排斥反应、性质稳定和血液清除速度快；（4）容易制备合成。
2 光学分子探针的分类与结构
根据探针的作用原理，光学分子探针分为：非特异性光学分子探针、可激活光学分子探针和特异性光学分子探针[4]。
2.1 非特异性光学分子探针 非特异性光学分子探针通常是指一些小分子游离荧光基团，经血管裂隙分布于细胞外组织中，由于病变和正常组织的灌注率或血管通透性不同，非特异性探针进入病变组织和正常组织的数量明显不同，因而可根据不同的光学分子影像进行靶向目标的识别，但这种探针对靶向目标缺乏特异性，导致目标-背景信噪比低，成像效果差[5]。
2.2 可激活光学分子探针 可激活光学分子探针也称作智能探针，其在初始状态下不发出光学信号，而一旦达到靶向目标被特定的生化或物理因子激活后即可发出强烈的光学信号而被检测[6]。
2.3 特异性光学分子探针 特异性光学分子探针又称为靶向性探针，是指与靶向目标具有亲和性的配体经过特定方法与生物素和荧光素等对比剂连接而组成。特异性光学分子探针由三部分组成：报告基团（Reporter Group）、连接基团（Spacer）和识别基团（Receptor），部分探针可不含有连接基团，且连接基团和识别基团连接后不应当影响识别基团的生物活性[7]。
2.3.1 报告基团 也称作信号基团，其作用是可以快速地富集在体内某一部位而被光学成像设备检测到信号。光学分子探针常见的报告基团有荧光素、荧光染料和量子点（Quantum Dots，QDs）等。
2.3.2 连接基团 也称作连接体，是指连接报告基团和识别基团的部分，因报告基团和识别基团一般结构较为复杂，两者如相距太近可能会导致彼此生物活性的改变，因此连接体可以减少信号基团和识别基团之间的相互反应。更为重要的是，连接体可以优化探针的药物代谢动力学特性。连接基团通常会对探针和靶向目标蛋白的结合产生重要影响，其长度、亲水性及所带电荷等方面都是影响探针活性的关键因素[8]。常用的连接基团有长链烷基和聚乙二醇等。长链烷基可以改善分子探针的脂溶性，有利于探针进入细胞；聚乙二醇则可改善分子探针的水溶性，有利于减少探针和非靶向目标蛋白的非特异性结合。脂溶性好的分子探针一般经过肝胆系统代谢，而水溶性好的分子探针一般通过泌尿系统清除[9]。
2.3.3 识别基团 也称作靶向基团，是指可以识别靶向目标蛋白并与之紧密结合，形成蛋白-探针复合物，是整个探针的核心部分。目前，科学家已经开发出多种靶向基团，包括抗体、多肽和小分子化合物等[10]。
2.3.3.1 抗体 抗体因为可以产生理想的配体-受体结合反应，且对靶向目标有极高的特异性及亲和性，作用机制明确，因此被广泛批准应用于临床。如前列腺特异性膜抗原（Prostate-specific Membrane Antigen，PMSA）在前列腺癌的诊断、治疗及预后评估等方面都发挥着重要作用，Liu等[11]应用PMSA抗原抗体成功制备了Cy5.5-CTT-54.2特异性近红外荧光探针，经实验表明可被用于前列腺肿瘤的靶向体外光学成像。但是抗体分子量较大，影响了探针的组织穿透力，异种抗体容易诱导机体产生不良的免疫反应，并且体内代谢缓慢，这些缺点限制了其在临床上的应用[12]。为了改善上述不利因素，抗体片段被开发应用，大大改善了探针的药代动力学特性，但此类探针相对于完整的抗体，其制备工艺更加复杂，价格昂贵，目前临床上应用较少[13-14]。
2.3.3.2 多肽 多肽是多个氨基酸残基组成的肽段。小分子多肽有许多优点：（1）易于化学合成，克服了抗体异源性问题；（2）制备技术可控，能够保证探针的物理化学及生物性能；（3）具有高度亲和力；（4）分子量小，可以较容易地通过生理屏障，血液清除速度快[15-16]。因此小分子多肽可以作为理想的探针应用于光学成像。有些肿瘤可以高表达某些受体，而表皮生长因子（EGF）、奥曲肽等天然多肽能够与这些受体特异性的结合，可用于肿瘤的检测。王可铮等[17]用近红外荧光染料Cy5.5标记EGF合成了探针（Cy5.5-EGF），对乳腺癌裸鼠移植瘤模型进行活体光学成像，表明探针Cy5.5-EGF可以与乳腺癌细胞表面的表皮生长因子受体（EDFR）特异性结合而用于乳腺癌的靶向诊断。Lanzardo等[18]应用近红外荧光染料标记RGD环肽作为光学探针，用来评价整合素αvβ3受体高表达的U87MG胶质母细胞瘤细胞移植裸鼠模型，体外和体内实验都证实，在U87MG细胞中RGD环肽与αvβ3整合素受体具有较高的特异性和亲和力，表明NIRF-RGD能灵敏而特异地探测胶质母细胞瘤。但是随着研究的深入，天然多肽已经无法满足分子影像学的需求，因此开发针对不同肿瘤、不同表面抗原更具特异性的多肽已成为当今研究的热点。
Smith等[19]于1985年报道了外源多肽在单链噬菌体表面表达的现象，从而使噬菌体展示文库技术成为筛选肿瘤特异性多肽重要的工具并迅速应用。Chen等[20]应用噬菌体展示文库技术筛选得到恶性神经胶质瘤U87MG细胞系导向肽CGNSNPKSC九肽序列，命名为GX1，并用近红外荧光染料Cy5.5标记此多肽制备成了Cy5.5-CGNSNPKSC特异性光学分子探针，经体内体外实验证实，该探针能特异性的与U87MG肿瘤结合，可用于恶性神经胶质瘤的靶向诊断。小分子多肽虽有许多优点，但其在体内易降解，部分靶点未知等缺点也是目前亟待解决的问题。
2.3.3.3 小分子化合物 某些小分子化合物如叶酸、双磷酸盐等能够和肿瘤细胞膜表面一些特异性受体靶向结合，可以作为特异性靶向探针的识别基团。如叶酸受体（FR）可在大部分恶性肿瘤，如卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、肾癌、结肠癌等表面过量表达，叶酸（FA）可与叶酸受体特异性结合从而用于检测相关恶性肿瘤。邓大伟等[21]成功制备了叶酸-PEG-ICG-Der-01近红外荧光靶向探针，并与过度表达叶酸受体的肿瘤靶向结合，定位准确，说明该探针具有肿瘤靶向的特性，对肿瘤的早期诊断有十分重要的意义。但小分子化合物易受体内原有分子的影响，显像基团标记化合物后药代动力学可能会有改变。
3 靶向光学分子探针设计的基本原则
光学分子成像探针可以看作是药物的一个亚类，因此传统药物设计时所用到的知识和经验，可以用于光学分子成像探针的设计。分子探针的理化性质，如电离常数（pKa值），脂溶性的和稳定性，被普遍认为是影响探针在体内的药代动力学的关键因素，包括探针的吸收、分布、代谢和排泄。因此在成像探针的设计和开发初期应当认真考虑这些问题。分子探针的电离作用和溶解度与细胞膜的通透性密切相关。许多分子成像探针含有不同的离子基团，在生理pH值范围内带有不同的电荷，分子探针的总电荷或电荷分布会影响其在体内的溶解度，渗透性以及与活性位点的亲和性。
3.1 生物特异性与生物活性策略 为了设计出靶向特异性光学分子探针，识别基团应当能够与靶向目标特异性结合，而不与背景组织结合[22]。而且由于分子探针结构中既包括核心部分识别基团，也包括连接基团和报告基团，合成后得到的分子探针其生物学特性可能发生改变。因此在合成探针以前，应当对探针结构的各个组成部分与生物活性之间进行构效关系研究，在不改变探针各部分生物学活性的情况下再进行探针的合成[7]。
3.2 药代动力学策略 传统的靶向分子探针无论是否与靶向目标结合均能发出信号，导致目标-背景信噪比较低，成像效果不佳，必须经过一段时间的代谢，大部分未结合的游离探针被机体清除后，目标-背景信噪比增强，才能达到最佳成像效果[6]。应用此类探针需要设法尽快洗去未结合的探针，使游离探针的清除时间尽量缩短，但在实际操作中并不容易做到。新型的“可激活”靶向分子探针只有与靶向目标特异性结合之后才发出信号，因此可以有更长的清除时间，使探针在靶向组织或细胞中充分富集，目标-背景信噪比可增加数百倍。例如，利用单克隆抗体IgG合成传统的靶向分子探针，其清除时间较长，导致了高背景信号和低目标-背景信噪比。然而，应用同样的单克隆抗体IgG，与可激活信号载体结合后，即使未结合的探针仍然在循环中却依然可以达到高目标-背景信噪比。
光学分子探针在进行体外实验时通常具有较好的靶向性，但是在体内应用往往效果不佳，这是因为机体是一个非常精密的系统，许多复杂的防御机制会阻碍外源性分子在体内发挥作用。因此，理想的光学分子探针必须能够穿过生理或药理学屏障，以合适的浓度到达特定靶向目标并滞留一定的时间，以便在体外被光学成像手段检测到。首先，探针必须在体内循环中保持活性并避免被网状内皮系统（RES）摄取；其次，探针必须能够到达靶组织内并在此富集；最后，如果探针的作用靶点在细胞内部，那么探针必须能够穿透细胞膜。
4 靶向光学分子探针的结构设计
靶向光学分子探针的结构设计可以用（图1）来表示。最常见的方式是识别基团通过一个连接基团与报告基团相连（图1a），而且一种识别基团可以同时连接几个报告基团形成分子探针进行多模态分子成像[23]。另外，多个识别基团与一个或多个报告基团连接后能与多个靶向目标特异性结合，此类探针可用于多靶向分子成像[24]。此外，许多有机或无机的纳米颗粒可以同时作为识别基团和运输载体来行使功能[25]。最新研究证实，碳纳米管经表面功能化处理后，具有可以携带蛋白质、核酸片段及小肽段等生物分子进入细胞的能力，是一种非常有前途的运载工具。周非凡等[26]以单壁碳纳米管（SWNT）作为载体和光吸收剂，制备了SWNT-PEG-mAb靶向性光热转换探针，经体内实验证实该探针可以进入靶细胞内，从而达到靶向杀伤肿瘤细胞，降低正常组织损伤的目的。此外，识别基团和报告基团还可以被耦合到纳米颗粒表面或内部来改善探针的信号敏感性和光稳定性[27]。第二种方式是两种报告基团连接一种识别基团（图1b），可激活探针或智能探针属于此类探针范畴[28]，智能探针结构中距离较近的两个报告基团可能会导致自淬灭（Self-quenching），当探针到达靶向目标后被相应的酶激活才会发出荧光信号。第三种方式是一种报告基团作为核心，两种或多种识别基团与其连接（图1c）。总的来说，探针设计方式的选择是由多种因素共同决定的，包括具体的靶向目标以及所采用的成像方式等，为了合成理想的靶向特异性光学分子探针，探针的每一个组成部分都必须认真考虑。
5 小结与展望
光学分子成像是近些年来快速发展的一项新兴的技术，也是未来影像学研究的热点。虽然靶向性探针目前仍然存在着如探针的安全性、稳定性及组织相容性等许多问题，在临床上的应用尚不多，但随着新型的光学分子探针会不断设计合成，光学成像技术一定会日益成熟，并最终应用于临床，在肿瘤的早期诊断、早期治疗和治疗效果监测等方面做出巨大贡献。
参考文献
[1]石立兴，张继武.光学分子影像学及其应用[J].中国医学影像技术，2008，24（12）：2024-2026.
[2]郝雪佳，肖振平，姜慧杰.多模态分子影像研究进展及在肿瘤疾病诊断中的应用[J].中华医学杂志，2013，93（9）：20.
[3] Kobayashi H，Choyke P L.Target-cancer-cell-specific activatable fluorescence imaging probes：rational design and in vivo applications[J].Acc Chem Res，2010，44（2）：83-90.
[4] Ntziachristos V.Fluorescence molecular imaging[J].Annu Rev Biomed Eng，2006，8：1-33.
[5] Shah K，Weissleder R.Molecular optical imaging：applications leading to the development of present day therapeutics[J].NeuroRx，2005，2（2）：215-225.
[6]张龙江，祁吉.分子影像学中的一些常用术语[J].放射学实践，2005，2（4）：336-341.
[7]张煚，周虎臣.小分子探针在确定活性化合物的生物靶点中的应用[J].药学学报，2012，47（3）：299-306.
[8] Shiyama T，Furuya M，Yamazaki A，et al.Design and synthesis of novel hydrophilic spacers for the reduction of nonspecific binding proteins on affinity resins[J].Bioorg Med Chem，2004，12（11）：2831-2841.
[9] Chen K，Chen X.Design and development of molecular imaging probes[J].Current topics in medicinal chemistry，2010，10（12）：1227.
[10]张丹，和水祥，禄韶英，等.消化系肿瘤分子影像诊断的研究进展[J].世界华人消化杂志，2012，20（29）：2771-2776.
[11] Liu T，Wu L Y，Hopkins M R，et al.A targeted low molecular weight near-infrared fluorescent probe for prostate cancer[J].Bioorganic & medicinal chemistry letters，2010，20（23）：7124-7126.
[12] Olafsen T，Wu A M.Antibody vectors for imaging[J].Semin Nucl Med，2010，40（3）：167-181.
[13] Day J J，Marquez B V，Beck H E，et al.Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents[J].Curr Opin Chem Biol，2010，14（6）：803-809.
[14]韩月东，崔大祥，宦怡，等.荧光磁性纳米粒子与PSA单链抗体复合探针对前列腺癌的靶向显像和治疗[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2008，15（5）：406-411.
[15] Seung-Min L，Gil-Suk Y，Eun-Sang Y，et al.Application of phage display to discovery of tumor-specific homing peptides：developing strategies for therapy and molecular imaging of cancer[J].Methods Mol Biol，2009，9（512）：355-363.
[16] Wu C C，Lin E H，Lee Y C，et al.Identification of a new peptide for fibrosarcoma tumor targeting and imaging in vivo[J].BioMed Research International，2010，2010：167045.
[17]王可铮，申宝忠，李伟华，等.近红外荧光染料标记表皮生长因子探针在荷人乳腺癌裸鼠移植瘤中的分子成像研究[J].中华放射学杂志，2009，43（8）：872-877.
[18] Lanzardo S，Conti L，Brioschi C，et al.A new optical imaging probe targeting αvβ3 integrin in glioblastoma xenografts[J].Contrast Media Mol Imaging，2011，6（6）：449-458.
[19] Smith G P.Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science，1985，228（4705）：1315-1317.
[20] Chen K，Yap L P，Park R，et al.A Cy5.5-labeled phage-displayed peptide probe for near-infrared fluorescence imaging of tumor vasculature in living mice[J].Amino Acids，2012，42（4）：1329-1337.
[21]邓大伟，刘飞，曹洁，等.两种近红外荧光探针的合成及肿瘤靶向研究[J].中国激光，2010，37（11）：2735-2742.
[22] Kobayashi H，Choyke P L.Target-cancer-cell-specific activatable fluorescence imaging probes：rational design and in vivo applications[J].Accounts of Chemical Research，2010，44（2）：83-90.
[23] Deroose C M，De A，Loening A M，et al.Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET， small-animal CT，and bioluminescence imaging[J].Journal of Nuclear Medicine，2007，48（2）：295-303.
[24] Li Z B，Wu Z，Chen K，et al.18F-labeled BBN-RGD heterodimer for prostate cancer imaging[J].Journal of Nuclear Medicine，2008，49（3）：453-461.
[25] Gao X，Yang L，Petros J A，et al.In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16（1）：63-72.
[26]周非凡，宋盛，吴宝艳，等.靶向纳米探针介导的近红外激光热疗[J].激光生物学报，2011，20（1）：125-129.
[27] Zhou X，Zhou J.Improving the signal sensitivity and photostability of DNA hybridizations on microarrays by using dye-doped core-shell silica nanoparticles[J].Analytical Chemistry，2004，76（18）：5302-5312.
[28] Elias D R，Thorek D L J，Chen A K，et al.In vivo imaging of cancer biomarkers using activatable molecular probes[J].Cancer Biomarkers，2008，4（6）：287-305.
（收稿日期：2013-10-14） （本文编辑：欧丽）