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[摘要] 目的：研究淫羊藿次苷Ⅱ，知母皂苷AⅢ，甲基莲心碱，红景天苷对PANC-1移植瘤的作用。方法：建立PANC-1皮下移植瘤模型，成瘤后随机分组，治疗组给予中药单体腹腔注射，23 d取瘤称重，部分组织中性福尔马林固定做免疫组化，其余组织液氮速冻，然后转移至-80 ℃冰箱保存做基因蛋白分析。免疫组化Ki67观察肿瘤增殖情况，RT-PCR检测瘤组织VEGF mRNA表达情况，Western blotting检测瘤组织VEGF蛋白表达。结果：与模型组比较，知母皂苷AⅢ（1.0 mg·kg-1）能抑制肿瘤生长（P<0.05），能降低VEGF mRNA（P<0.05）和VEGF蛋白表达（P<0.05），活化Caspase-3蛋白。淫羊藿次苷Ⅱ，甲基莲心碱，红景天苷的抗肿瘤作用不显著。结论：知母皂苷AⅢ其抗肿瘤作用与抑制VEGF及促进肿瘤凋亡有关。
[关键词] 中药单体；血管内皮生长因子；凋亡
胰腺癌是恶性程度极高的消化系肿瘤，近30年来发病率已增长3～7倍 [1]。胰腺癌致死率高，目前的化疗放疗仍然不能很好的治疗胰腺癌。中药在肿瘤治疗过程中发挥着重要作用，因此，开发具有抗肿瘤的中药有很大潜力。体外研究显示，淫羊藿次苷Ⅱ诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡[2]；知母皂苷AⅢ能抑制HCT-15结肠癌细胞[3]、乳腺癌MDA-MB-231和MCF-10A细胞[4]、人宫颈癌Hela细胞[5]生长；甲基莲心碱有肿瘤增敏剂的作用[6]；红景天对肝癌、乳腺癌、胃癌及白血病等具有杀伤作用[7]。但体内研究报道较少。作者在前期体外筛选发现淫羊藿次苷Ⅱ，知母皂苷AⅢ，甲基莲心碱，红景天苷能一定程度的抑制PANC-1肿瘤细胞的生长。为了明确4种中药单体的体内抗肿瘤作用，进行了PANC-1裸鼠皮下移植瘤实验。
1 材料
1.1 药物与试剂 淫羊藿次苷Ⅱ，知母皂苷AⅢ，甲基莲心碱，红景天苷均购自同田生物技术有限公司，纯度≥98%。抗体Ki67一抗购自Abcam；抗体Caspase-3一抗购自CST；VEGF一抗购自R&D公司。Trizol、琼脂糖均购于上海生工公司。无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、甲醇均为国产分析纯，购自上海国药集团。引物VEGF购自生工生物科技有限公司。MMLV和RNA酶抑制剂由Promega公司提供，TaqDNA聚合酶，dNTP，DNA标准相对分子质量购自于博大泰克公司。
1.2 动物与细胞株 裸鼠，雌性，清洁级，中国科学院上海动物中心提供。动物使用许可证号SYXK（沪）2009-0069。人胰腺癌PANC-1细胞是由美国休斯顿医学院惠赠。
1.3 仪器 HEPA CLASS100 CO2培养箱（美国Thermo公司）；Delta series生物安全柜（Labconco， 美国）；Eppendorf Centrifuge 5810R低温高速离心机（德国）；PCR仪（德国Biometra公司）；GIS凝胶图像分析系统购自上海天能科技有限公司；单向电泳系统（美国Bio-Rad公司）；sMPIC2600C自动X线胶片洗片机（上海申贝办公机械有限公司）。
2 方法
2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 PANC-1用含10%新生牛血清（FCS）的DMEM培养基在37 ℃， 5%CO2培养箱中培养。传代细胞，用PBS调整细胞密度。在裸鼠左上肢腋下注射0.2 mL细胞混悬液，含2×106个细胞。用游标卡尺测量肿瘤的最长径及最短径，根据公式V=ab2/2计算肿瘤体积，a为长径、b为短径。
2.2 分组及给药 瘤长径3～5 mm后，将裸鼠随机分为模型组、淫羊藿次苷Ⅱ组（0.7 mg·kg-1）、知母皂苷AⅢ组（1.0 mg·kg-1）、甲基莲心碱组（0.8 mg·kg-1）、红景天苷组（0.4 mg·kg-1），每组6只。每隔1 d称重，测瘤长径，短径。每天腹腔注射中药单体，23 d处死动物，取瘤称重，组织切块液氮速冻，然后转移至-80 ℃冰箱保存。
2.3 免疫组化 石蜡包埋，切片，脱蜡和水化。滴加正常兔血清封闭液，室温20 min甩去多余液体。滴加一抗Ki67，浓度1∶50，4 ℃过夜。PBS洗2×3 min。滴加生物素标记二抗10 μL孵育20 min。PBS洗2×3 min。滴加试剂SABC室温孵育20 min。PBS洗4×5 min。DAB显色水洗终止反应。脱水透明封片镜检。显微镜下拍照。Ki67 阳性表达定位细胞核，为棕黄色，400倍光镜下拍照观察棕黄色反应区可以反映肿瘤细胞增殖情况。
2.4 RT-PCR检测VEGF mRNA Trizol法提取细胞总RNA，取1 μg总RNA配置逆转录反应体系，逆转录合成cDNA，并以此为模板利用PCR方法进行扩增。VEGF正向引物5′-CAGGGTCCTCTCCCCTGCCC-3′，反向引物5′-GATGCGCGTGCAGCATGTGG-3′； Actin正向引物5′-AGCTGAGAGGAAATCGTGCG-3′， 反向引物5′-GTGCCACCAGACAGCACTGTG-3′。PCR扩增产物10 μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳，应用数码凝胶成像分析系统拍照成像分析。
2.5 Western blotting检测VEGF，Caspase-3蛋白 称取50～100 mg组织加入含PMSF的RIPA裂解液超声后12 000 r·min-1离心15 min，取上清，即为总蛋白。蛋白定量，电泳：制SDS聚丙烯酰胺凝胶，12%分离胶、7.5%积层胶，将蛋白样品与4×上样缓冲液按3∶1体积混合后95 ℃变性5 min，每组上样20 μg。电泳条件：电压80 V，时间约2 h。转膜条件：400 mA电转60 min。以5%脱脂奶粉/TBST溶液摇床上封闭1 h。抗原抗体反应：封闭结束后，将膜放入塑料袋中，加入一抗溶液（一抗按1∶1 000稀释，GAPDH按1∶8 000稀释），4 ℃过夜，第2天室温1 h后，TBST洗涤 8 min×3次，加入相应二抗，室温1 h，TBST 洗涤8 min×3次。等量ECL发光剂混匀后浸膜2 min，吸干后覆以保鲜膜，于片夹内曝光10～60 s，自动X线胶片洗片机显影、定影。结果扫描后，经吸光度分析系统计算灰度值。
2.6 数据分析 采用SPSS 15.0统计软件进行数据统计，多组计量资料采用单因素方差分析，组内两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 中药单体对PANC-1移植瘤生长的影响 与模型组比较，知母皂苷AⅢ能明显抑制肿瘤生长（P<0.05），而淫羊藿次苷Ⅱ、甲基莲心碱、红景天苷瘤体积和瘤重轻微降低但没有显著性差异。与模型组比较，淫羊藿次苷Ⅱ、知母皂苷AⅢ、甲基莲心碱、红景天苷裸鼠体重没有明显差异（图1）。各用药组和模型组未发现裸鼠死亡。
3.2 对PANC-1裸鼠瘤细胞增殖的影响 Ki67 的表达与肿瘤细胞增殖密切相关。模型组棕黄色阳性肿瘤细胞较多，知母皂苷AⅢ用药组阳性细胞明显减少（图2）。
3.3 对PANC-1裸鼠瘤组织Caspase-3蛋白的影响 知母皂苷AⅢ能升高cleaved Caspase-3蛋白（图3），说明知母皂苷AⅢ促进了肿瘤凋亡，而其余各组未发生凋亡，提示知母皂苷AⅢ的抗肿瘤作用与促进肿瘤凋亡有关。
3.4 对PANC-1裸鼠瘤组织VEGF mRNA的影响 与模型组比较，知母皂苷AⅢ组裸鼠瘤组织VEGF mRNA表达明显降低（P<0.05）；淫羊藿次苷Ⅱ、甲基莲心碱、红景天苷给药组VEGF mRNA表达有一定程度降低，但没有显著性差异（图4）。
3.5 对PANC-1裸鼠瘤组织VEGF蛋白的影响 与模型组比较，知母皂苷AⅢ组VEGF蛋白表达明显降低（P<0.05）。而淫羊藿次苷Ⅱ，甲基莲心碱，红景天苷给药组能一定程度降低VEGF蛋白表达，但没有显著性差异（图5）。
4 讨论
血管内皮生长因子是一种有效的促进肿瘤血管生长的因子[8]。研究表明在胰腺癌细胞中存在VEGF高表达。Jane等[9]检测多种胰腺癌细胞株，如AsPC-l，BxPC-3，CFPA，HPAF2和PANC-l均有血管内皮生长因子及其受体的表达。VEGF对于血管发生起着十分重要的作用，抗血管生成是治疗肿瘤的重要策略。促进肿瘤细胞凋亡也被认为是一种治疗肿瘤的策略。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。在凋亡的早期阶段，活化的Caspase-3被认为是凋亡发生的早期分子标志[8]。
本实验结果显示知母皂苷AⅢ能明显抑制 PANC-1移植瘤生长。免疫组化也显示知母皂苷AⅢ抑制肿瘤生长。另外还发现，知母皂苷AⅢ的抗肿瘤作用除了抑制VEGF，还能活化Caspase-3促进肿瘤凋亡。知母皂苷AⅢ其抗肿瘤作用与抑制VEGF及促进肿瘤细胞凋亡有关。另外，淫羊藿次苷Ⅱ、甲基莲心碱、红景天苷抑制肿瘤作用不明显，是否加大给药剂量能明显抑制肿瘤生长，尚需进一步研究。
[参考文献]
[1] 王玉兰，韦立新，顾倬云，等.胰腺癌伴随炎症的病理学研究[J].肝胆外科杂志，2008， 16（14）： 266.
[2] Lee K S， Lee H J， Ahn K S， et al. Cyclooxygenase-2/prostaglandin E2 pathway mediates icariside II induced apoptosis in human PC-3 prostate cancer cells [J]. Cancer Lett， 2009， 280（1）： 93.
[3] Kang Y J， Chung H J， Nam J W， et al. Cytotoxic and antineoplastic activity of timosaponin A-III for human colon cancer cells [J]. J Nat Prod， 2011， 74（4）： 701.
[4] King F W， Fong S， Griffin C， et al. Timosaponin AIII is preferentially cytotoxic to tumor cells through inhibition of mTOR and induction of ER stress [J]. PLoS One， 2009， 4（9）： e7283.
[5] Sy L K， Yan S C， Lok C N， et al. Timosaponin A-III induces autophagy preceding mitochondria-mediated apoptosis in HeLa cancer cells [J]. Cancer Res， 2008， 68（24）： 10229.
[6] 李琴，商晶.甲基莲心碱的药理作用研究进展[J].海峡药学，2012， 24（1）： 37.
[7] 翟笑枫.红景天抗肿瘤作用机制研究进展[J].中国民族民间医药，2010， 19（17）： 3.
[8] Fujioka S， Yoshida K， Yanagisawa S， et al. Angiogenesis in pancreatic carcinoma： thymidine phosphorylase expression in stromal cells and intratumoral microvessel density as independent predictors of overall and relapse-free survival [J]. Cancer， 2001， 92（7）： 1788.
[9] Wey J S， Fan F， Gray M J.Vascular endothelial growth factor receptor-1 promotes migration and invasion in pancreatic carcinoma cell lines [J]. Cancer， 2005， 104（2）： 427.
Effects of four kinds of Chinese medicine monomer on growth of PANC-1
xenograft tumor and studying of molecular mechanism
PAN Hui-jun 1， NIE Xu-qiang1， LIU Duo 1， BIAN Ka1，2*
（1.Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional
Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；
2.Division of Nitric Oxide and Inflammatory Medicine， E-Institute of Shanghai Universities， Shanghai 201203， China）
[Abstract] Objective： The antitumor effects of icarisid Ⅱ， timosaponin A-Ⅲ， neferine and salidroside were studied in PANC-1 xenograft tumor. Method： To establish of the nude mice xenograft tumor model， PANC-1 cells were injected. When the tumor major diameter was reached 3-5 mm， the treatment was initiated. The mice were randomized into vehicle control and treatment groups of six animals per each. Chinese medicine monomer was injected intraperitoneally every day. In 23th day， mice were killed once a day， tumor tissue were isolated and weighed and divided into two parts. One part was fixed with formaldehyde for tissue section and immunohistochemistry， the another of tissue was frozen in liquid nitrogen then in -80 ℃ refrigerator for gene and protein expression analysis. Result： In PANC-1 tumor xenograft experiment， compared with model group， timosaponin A-Ⅲ （1.0 mg·kg-1） exerted significant inhibitory effects on tumor growth. Timosaponin A-Ⅲ suppressed mRNA expressions of VEGF （P<0.05）， reduced protein expressions of VEGF （P<0.05）， activated Caspase-3 protein. Icarisid Ⅱ， neferine and salidroside had not an excelled antitumor effect. Conclusion： Timosaponin A-Ⅲ exerted an excelled antitumor effect. The antitumor mechanisms include anti-angiogenesis， apoptosis promotion.
[Key words] Chinese medicine monomer； vascular endothelial growth factor； apoptosis
doi：10.4268/cjcmm20130220
[责任编辑 张宁宁]