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摘 要 目的：构建针对人几丁质酶-3样蛋白-1（chitinase-3-like protein-1， CHI3L1）基因的短发卡RNA（short hairpin RNA， shRNA）干扰表达载体，观察CHI3L1基因表达对人胃癌细胞株BGC-823细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：根据人CHI3L1基因序列设计并构建CHI3L1基因的shRNA真核表达载体，通过荧光显微镜观察转染效果。应用逆转录-聚合酶链反应和Western-Blot方法检测BGC-823细胞的CHl3L1 mRNA和CHl3L1基因的表达，通过平板克隆形成实验观察BGC-823细胞的增殖情况，通过Transwell实验观察BGC-823细胞侵袭能力的变化。结果：建立了稳定表达CHI3L1 shRNA的BGC-823细胞的CHI3L1 mRNA和CHI3L1基因的表达均显著减少，且见CHI3L1 shRNA可显著抑制BGC-823细胞的增殖和侵袭能力。结论：干扰CHI3L1基因的表达可显著抑制BGC-823细胞的增殖和侵袭能力。
关键词 胃癌 人几丁质酶-3样蛋白-1 增殖 侵袭
中图分类号：R735.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）21-0062-04
Expression of human chitinase-3-like protein-1 in gastric cancer and its effect on proliferation and invasion of gastric cancer cells*
SI Xianke**， LI Wei， YU Kun， ZHANG Jixun， CAO Yijun， YANG Jiahua***（Department of General Surgery， Putuo Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200062， China）
ABSTRACT Objective： To construct a short hairpin RNA （shRNA） interference expression vector containing a gene encoding human chitinase-3-like protein-1 （CHI3L1） and observe the effect of CHI3L1 gene expression on the proliferation and invasion of human gastric cancer cell line BGC-823. Methods： The shRNA eukaryotic expression vector containing a gene encoding human CHI3L1 was designed and constructed based on CHI3L1 gene sequence and the transfection effect was observed by fluorescence microscopy. CHl3L1 mRNA and its gene expression in BGC-823 cells were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Western-Blot. The proliferation and the invasion ability of BGC-823 cells were observed by clonogenic assay and Transwell method. Results： CHI3L1 mRNA and CHI3L1 expression in BGC-823 cells were significantly reduced and the proliferation and the invasion ability of BGC-823 cells were significantly inhibited by CHI3L1 shRNA. Conclusion： The expression of interference CHI3L1 can significantly inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cell.
KEy WORDS gastric cancer； human chitinase-3-like protein-1； proliferation； invasion
目前認为，胃癌的侵袭、转移是一个连续、复杂的主动过程，与多种相关基因和分子标志物有关[1]。既往研究发现，人几丁质酶-3样蛋白-1（chitinase-3-like protein-1， CHI3L1）在多种肿瘤的增殖、侵袭和转移过程中起着重要作用[2-3]。但对人CHI3L1在人胃癌细胞中的表达及其可能的意义却迄今尚无系统性的研究。本实验通过构建靶向干扰人CHl3L1的重组慢病毒表达载体，观察其对人胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
人胃癌细胞株BGC-823细胞和人胚肾上皮细胞株HEK 293T细胞（均由上海交通大学医学院附属新华医院提供）。
1.1.2 主要试剂与仪器
BCA蛋白定量试剂盒、化学发光检测试剂盒和蛋白电泳制胶所需试剂（均为上海秀材生物技术有限公司产品）；RP-MI1640培养基、胎牛血清和DMEM培养基（均为美国GIBCO公司产品）；慢病毒转移载体pGMLV、重组穿梭质粒和包装质粒pAX2（均为德国Qiagen公司产品）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）试剂盒（日本Takara公司产品）。
荧光定量PCR仪、荧光显微镜和自动酶联免疫分析仪（均由上海市普陀区中心医院中心实验室提供）。
1.2 方法
1.2.1 慢病毒干擾载体的构建
针对目的基因CHI3L1基因，应用公用网站中提供的RNA干扰序列（XM 005244857.1 PREDICTED： Homo sapiens chitinase-3-like l， mRNA）设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，然后根据设计经验和设计软件进行测定、评估，选择具有最佳动力学参数的干扰靶点序列进入后续实验流程。根据CHI3L1基因分别设计并合成3对短发卡RNA（short hairpin RNA， shRNA）寡聚单链DNA，退火成双链RNA，再将此3对双链RNA的shRNA寡聚单链DNA序列的5’ to 3’序列分别插入至shRNA慢病毒载体中，构建出3个shRNA慢病毒重组质粒，并转化至DH5α感受态细胞中，最后成功构建成pGMLV-SC1 RNAi慢病毒载体。
1.2.2 慢病毒的包装
胰酶消化对数生长期的HEK 293T细胞，然后将其接种于10 cm细胞培养皿中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞密度达60% ～ 70%时，加入质粒和磷酸钙的混合液，混匀后培养6 ～ 8 h。弃去含有转染混合物的培养液，清洗后再加入6 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72 h。收集转染72 h后的 HEK 293T细胞上清液，于4 ℃、4 000 r/min下离心10 min，然后以0.45 μm滤器过滤。超速离心（25 000 r/min）2 h，以冰磷酸盐缓冲液重旋病毒沉淀，4 ℃下溶解过夜。
1.2.3 病毒滴度的测定
病毒滴度测定的前1天，对HEK 293T细胞进行传代，96孔培养板上每个孔中加入100 μl的病毒原液（约5×104个细胞/ml），第2天确认细胞状态没有问题。准备3 ～ 5个无菌EP管，每管中加入90 μl DMEM完全培养基和10 μl待测病毒原液，轻轻混匀。吸去90 μl培养基，然后将稀释好的病毒液从低浓度到高浓度依次加至培养板的孔中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后再在每孔中加入100 μl的新鲜培养基，小心操作，不要吹起细胞。72 h后，通过荧光显微镜计数荧光细胞，并结合稀释倍数计算病毒滴度。
1.2.4 细胞转染
将BGC-823细胞加至含5%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。按照操作说明书进行shRNA真核表达载体（shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3）和shRNA空白载体的转染。对处于对数生长期的BGC-823细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液，然后将细胞悬液（约含5×104个细胞）接种于6孔培养板上，于37 ℃、5% CO2恒温箱中孵育24 h。将慢病毒和磷酸钙的混合液按感染指数10∶1转移至含单层细胞的培养液中并混匀，培养6 ～ 8 h后弃去含有转染混合物的培养液。以磷酸盐缓冲液冲洗3次，再在6孔培养板的每个孔中加入1 ml RP-MI1640培养基，于37 ℃、5% CO2恒温箱中孵育48 h。应用免疫荧光显微镜观察转染效果。
1.2.5 Western-Blot实验
制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。电泳分离CHI3L1蛋白后转膜，将膜取出，转移至塑料自封袋中，加入10 ml封闭液静置1 h。倒出封闭液，加入4 ml一抗溶液，于4 ℃下水平摇床上孵育过夜。室温下，将膜在磷酸盐缓冲液中浸洗3次，15 min/次。同一抗操作，取出膜，转移至塑料自封袋中，加入4 ml二抗溶液，室温下孵育1 h，然后再将膜在磷酸盐缓冲液中浸洗3次，15 min/次。将混合后的检测试剂均匀加至杂交膜上，反应3 ～ 5 min。用薄膜覆盖杂交膜，赶出多余发光液，在暗房中压片、显影。
1.2.6 平板克隆形成实验
将构建好的稳转系细胞进行胰酶消化、计数，然后接种于6孔培养板上，每孔接种100个细胞，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2周，期间观察细胞的生长状态。应用4%多聚甲醛固定法室温固定30 min，再用0.1%结晶紫染色15 min，扫描拍照。
1.2.7 Transwell实验
向Transwell小室的上孔均匀加入已预作饥饿处理的细胞悬液，每孔中约5×104个细胞，再在上层加无血清培养基，下层加含血清的培养基，8 ～ 24 h后观察细胞的穿透情况。应用4%多聚甲醛固定法室温固定30 min，然后用0.1%结晶紫染色15 min。用水冲洗掉结晶紫后，将上层细胞擦掉。随机选择5个视野，于显微镜下观察上层细胞下底面的细胞。
2 结果
2.1 CHI3L1的慢病毒包装及稳转系的构建
从图1可知，已在BGC-823细胞中成功构建了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3稳转系。
2.2 Western-Blot实验检测BGC-823细胞稳转系中CHI3L1的表达水平
从图2可知，在已构建了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3稳转系的BGC-823细胞中，CHI3L1的表达均显著减少。
2.3 平板克隆形成实验检测CHI3L1 shRNA对BGC-823细胞增殖的影响
从图3可知，稳定转染了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3的BGC-823细胞的克隆数显著减少，说明CHI3L1 shRNA-1、CHI3L1 shRNA-2和CHI3L1 shRNA-3均能显著抑制BGC-823细胞的增殖。
2.4 Transwell實验检测CHI3L1 shRNA对BGC-823细胞侵袭能力的影响
从图4可知，CHI3L1 shRNA-1、CHI3L1 shRNA-2和CHI3L1 shRNA-3均能显著抑制BGC-823细胞的侵袭能力。
3 讨论
CHI3L1基因位于1号染色体q32，由分布于8 kb区域上的10个外显子构成，含383个氨基酸。CHI3L1是结缔组织细胞的生长因子，同时也是内皮细胞之间形成黏附和发生迁移的重要因素[4]。CHI3L1与多种疾病相关，包括哮喘[5]、冠心病[6]、炎症性肠病[7]、精神分裂症和2型糖尿病等。近年研究还发现，CHI3L1水平升高与多种肿瘤的增殖、分化、浸润、侵袭和转移密切相关[8-11]。例如，Junker等[12]研究发现，在小细胞肺癌中，CHI3L1的表达与肿瘤的增殖和转移密切相关；Pelloski等[13]研究发现，在胶质瘤中，CHI3L1的表达可引起肿瘤增殖，且与肿瘤对放疗的不敏感性相关，致使预后不佳；付亮等[14]研究发现，CHI3L1在胆囊癌中高表达，其表达水平与胆囊癌的淋巴结转移及预后密切相关。
RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术是一种采用双链RNA诱发mRNA水平上的基因沉默、进而抑制蛋白产物表达的技术。Libreros等[15]应用RNAi技术抑制乳腺癌细胞中CHI3L1的表达，引起趋化因子配体-2、巨噬细胞炎性蛋白-2和基质金属蛋白酶-9等分泌减少，导致肿瘤增殖和侵袭能力减弱。Ku等[16]的研究发现，应用RNAi技术使CHI3L1基因沉默、抑制CHI3L1的表达可抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力。本实验选用慢病毒构建的RNAi表达载体使人胃癌细胞株BGC-823细胞的CHI3L1基因沉默，转染成功后，通过PCR和Western-Blot实验检测发现，BGC-823细胞中的CHI3L1 mRNA水平和CHI3L1表达均受到抑制。此外，通过平板克隆形成实验观察到，稳定转染了CHI3L1 shRNA的BGC-823细胞的增殖速率也显著降低；通过Transwell实验观察到，稳定转染了CHI3L1 shRNA的BGC-823细胞的侵袭能力亦显著减弱，其中稳定转染了CHI3L1 shRNA-2的BGC-823细胞的侵袭能力最弱。
Kawada等[17]的研究发现，在结肠癌细胞中，CHI3L1是主要通过激活胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases， ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）信号通路而产生诱导白介素-8和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1， MCP-1）分泌的。因此，我们猜测，CHI3L1在胃癌细胞中可能也是主要通过激活ERK和JNK信号通路而促进白介素-8和MCP-1的表达，进而促进胃癌细胞的增殖和侵袭、转移的。当然，确切的分子机制尚待我们未来实验的深入研究。
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