【摘要】目的：观察中晚期肝癌患者行自体DC-CIK细胞联合替吉奥治疗的临床疗效及不良反应。方法 采集48例中晚期原发性肝癌患者外周血单个核细胞，加入细胞因子定向诱导DC及CIK，8d后将扩增的DC及CIK细胞以静脉回输的方式，对患者进行自体DC-CIK细胞输注治疗，同时联合口服替吉奥治疗。结果 自体DC-CIK联合替吉奥治疗12周后CR0例PR10例，SD22例，PD16例，总有效率（RR）为20.8%，疾病控制率（DCR）为66.7%。患者免疫功能提高，生活质量改善。结论 自体免疫细胞联合替吉奥治疗中晚期肝癌疗效尚可，副作用小，安全性好。
【关键词】树突状细胞（DC）；细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）；替吉奥；肝癌；
【中图分类号】R9145 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）04-0150-02
原发性肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年上升，已超过62.6万/年，而我国占全球总数的55%，每年约有30万人死于肝癌，在肿瘤相关死亡中位居第二为，仅次于肺癌[1]。尽管外科手术水平和肝癌移植技术已经取得了巨大的进步，但由于肝癌起病隐匿，侵袭生长迅速，80%以上的肝癌患者在确诊时已存在肝癌播散、远处转移、门脉癌栓或伴有严重的肝硬化，不能进行手术，甚至是介入、微波等治疗均存在限制，包括全身化疗在内的非手术疗法仍不失为延长生存、提高生活质量的重要方法。随着替吉奥、卡培他滨等新型化学治疗药物的问世，口服单药化疗逐渐成为临床上采用的姑息性治疗方法[2]。肿瘤生物免疫治疗做为一种新兴的治疗手段成为近年来肿瘤治疗领域关注的热点问题。树突状细胞（Dendritic cells DC）是目前已知体内功能最强的抗原提呈细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells CIK）是一种在体外经细胞因子诱导、增殖而得的具有抗瘤谱广、杀瘤活性高的特性的免疫活性细胞。为此，本研究采用DC-CIK自体免疫细胞联合替吉奥治疗48例中晚期肝癌患者，取得一定疗效，现报告如下。
1资料与方法
1.1 病例资料
1.1.1 入选标准：（1）经影像学或病理活检确诊的中晚期肝癌患者，无法行手术治疗，不适合或不考虑行肝动脉栓塞化疗者；（2）患者自愿接受上述治疗并签署同意书；（3）肝功能Child-Pugh分级为A或B患者；（4）各项常规、生化检查指标无相关禁忌症；（5）Kamofsky评分≥60，无严重的心、肺、肾功能障碍及全身恶液质情况；（6）预计生存期大于3个月；（7）无明显感染，无精神类疾病。
1.1.2 研究对象：我科2011年1月-2013年5月经检查确诊为中晚期肝癌的患者48例，其中男34例，女14例，年龄31-72岁，平均年龄48.6岁，经影像学或病理活检确诊但无法行手术治疗，不适合或不同意行肝动脉栓塞化疗者。巨块型肝癌26例，多发结节型肝癌22例，其中外科手术失败或术后复发患者占9例。患者肝内病灶大小在2×3cm-13.0×15.1cm之间，含肝硬化、门静脉及下腔静脉癌栓、腹腔积液、黄疸、远处转移者。28例病例有原发病或/和转移瘤的病理学或组织细胞学证据，所有病例均有相应的影像学资料，有可见原发灶或/和转移病灶可供评估疗效。
1.2 治疗方法
所有入组病例均先行外周血单核细胞采集，标本送实验室行DC-CIK细胞培养及扩增，后开始口服替吉奥治疗，细胞培养完成后安排自体DC-CIK细胞输注治疗。12周为1个疗程，如无明显不良反应则重复疗程。治疗期间每周查血常规1次，每2周查肝功能1次，白细胞计数<3×109/L或肝功能异常时停药2周后进行评价，对药物反应性好及可耐受治疗者停药2-4周后可继续治疗。
1.2.1 替吉奥（S-l）治疗
根据体表面积来确定初始剂量，体表面积<1.25m2，S-l 40mg/次，2次/d；体表面积1.25～1.5m2，S-1 50mg/次，2次/d；体表面积>1.5m2，S-l 60mg/次，2次/d，早饭后和晚饭后分别口服1次，连续服用28 d（4周），停药14d（2周）。12周为1个疗程。
1.2.2 DC-CIK治疗
（1）细胞分离 经CS-3000血细胞分离机采集患者外周血5L中的新鲜抗凝外周血单核细胞，再用聚蔗糖400（Ficoll 400）分离后经Hank′s液洗3次，收集纯度在90%以上的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMNC）。
（2）CIK体外培养和扩增 将PBMNC加入到含1000U/mL IFN-γ和自体血清的完全培养基中，调整细胞浓度至2.0×106个/mL，24h后加入IL-2 1000U/mL和CD3单抗0.5 μg/mL，后根据CIK生长情况每隔2d～3d适时补充培养基和IL-2，置于37°C，5%CO2培养箱中培养10d～14d后。每周2次测定白细胞增殖率和CD3、CD56阳性细胞率，当细胞数扩增达到设计目标，阳性目标细胞达到85%时，离心收集细胞，同时取样做质量检控（参照柯莱逊《质量检控标准》CLS-T-W-009）。将合格的CIK分4次静脉回输至患者体内，单次回输CIK数目不少于1.0×109个。
（3）DC体外培养和扩增 将CS-3000分离的到的PBMNC用无血清1640培养液重悬，浓度为2×106/ml铺入6孔板，孵育2h后弃上清，获得贴壁单核细胞，加入DC完全培养基（含GM-CSF 100ng/mL和IL-4 500U/mL），置于37°、5%CO2培养箱中；培养第5d加入TNF-α诱导DC成熟，第7～8d收集悬浮的DC，同时取样做质量检控（参照柯莱逊《质量检控标准》CLS-T-W-009）。将合格的DC分4次静脉回输至患者体内，单次回输DC数目不少于1.0×107个。
（4）细胞回输方案 患者一般状况良好，细胞培养成熟后开始交替回输CIK和DC，2～3次/周，一次回输CIK不少于1×109个，DC不少于1×107个。
（5）外周血免疫功能检测 细胞治疗前及治疗完成4周后检测患者外周血T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+）变化。
1.3 观察及疗效评估
观察指标包括治疗前后瘤体变化、外周血免疫指标、肿瘤标志物、症状改变、生活质量及不良反应等。疗效评估采用美国癌症研究所制定的实体肿瘤RESIST疗效评估方法，将疗效分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）、进展（PD），总有效率（RR）=CR+PR，疾病控制率（DCR）=CR+PR+SD[5]。记录患者治疗前后食欲、睡眠、精神、体力等情况，用 Karnofsky 计分法（见附录B）判断治疗前及治疗后生活质量的改善情况，凡在治疗后较治疗开始前计分提高10分以上者为改善，下降10分以上者为恶化，提高或下降10分者为稳定，总提高率=（改善+稳定）×100%。不良反应按WHO抗肿瘤药物不良反应的分度标准，分为0～Ⅳ度[5]。
1.4 统计学方法
实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用配对t检验进行比较。P<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1 瘤体变化
48例中晚期肝癌病例均有可测量病灶，经DC-CIK联合替吉奥治疗1周期（12周）后，采用彩超、CT、MRI等影像学检查方法测量病灶大小，按RESIST实体瘤的近期疗效标准，其中CR 0例，PR 10例，SD 22例，PD 16例，总有效率（RR）为20.8%，疾病控制率（DCR）为66.7%。
2.2 外周血免疫指标变化
接受DC-CIK联合替吉奥细胞治疗的48例中晚期肝癌患者，其治疗前后外周血免疫指标分析结果显示：总T淋巴细胞（CD3+）、T辅助细胞CD4+百分率，CD4+/CD8+比值明显上升，与治疗前对比差异有统计学意义（P﹤0.05），NK细胞（CD16+CD56+）比例较前上升，T毒性/抑制细胞（CD3+CD8+）较前下降，但P﹥0.05（见表1）。
2.3 临床症状缓解情况
48例中晚期肝癌患者经1疗程（12周）治疗后在乏力、食欲不振、疼痛腹水、黄疸、腹胀等方面得到明显缓解。（见表2）
2.4 KPS评分变化情况
经积极治疗后，大部分患者的KPS评分均得到提高，平均提高10～20分，总提高率高达89.6%。
2.5 毒副反应
主要的不良反应是中性粒细胞减少、消化道反应及皮肤色素沉着，其中Ⅰ度粒细胞减少者6例，Ⅱ度减少2例，无Ⅲ、Ⅳ度减少者，经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）治疗后粒细胞计数恢复正常，不影响继续用药。6例患者出现恶心症状，2例患者出现短暂呕吐，48例患者均未出现Ⅲ度及以上消化道反应。3例患者治疗后出现丙氨酸氨基转移酶（ALT）轻度升高，加强护肝治疗后ALT恢复正常并完成治疗。4例患者回输DC-CIK细胞后出现发热，体温均低于38.6℃，持续时间2～6小时，有1例给予酚咖片处理外，其他3分自行缓解。
3讨论
晚期原发性肝癌至今尚没有标准的治疗方案，与手术及介入治疗相比，肝癌的全身化疗始终处于艰难的探索中。其重要原因之一是肝癌细胞存在着多种耐药机制，如多药耐药基因及其蛋白的高表达、p53基因突变、bcl-2和bc-lxl的异常表达等。另外，还存在着与谷胱甘肽-S-转移酶、拓扑异构酶和热休克蛋白等相关的耐药[2]。化疗的目的是提高患者的生存质量，延长患者的生存期。首选有效性的同时，还应对药物的副反应进行比较，特别是原发性肝癌患者，应该选择毒副反应小药物用于治疗。
替吉奥是一种氟尿嘧啶衍生物口服抗癌剂，是替加氟（FT）、吉美嘧啶（CDHP）和奥替拉西钾（Oxo）三种药物组成的复方制剂，组成摩尔比1：0.4：1.FT是5-FU的前体药物，口服吸收经肝药酶作用持续转化为5-FU。CDHP是二氢嘧啶脱氢酶的强效抑制剂，可延长血液和肿瘤组织中的5-Fu的药效时间，从而取得与5-Fu持续静脉输注类似的疗效。Oxo能够阻断5-Fu的磷酸化，减轻了5-Fu引起的胃肠道不良反应。替吉奥与5-Fu相比具有以下优势：①能维持较高的血药浓度并提高抗癌活性；②明显减少药毒性；③给药方便。替吉奥在胃癌上已显示较好的疗效，甚至可以与联合方案相媲美，在原发性肝癌的小样本研究中也显示出可喜的效果，且与5-Fu不完全交叉耐药[3]。
乙型肝炎病毒慢性感染是我国肝癌的主要致病原因，患者体内存在有不同程度的免疫功能缺陷。研究显示[4]，肝癌患者存在外周血DC成熟障碍状况，主要表现为循环DC低表达MHC-Ⅱ和IL-12；摄取抗原颗粒以及同种T细胞刺激能力下降。我们应用的DC是经过体外活化和扩增，并经过肝癌组织特异性抗原（AFP）刺激的成熟DC，国外实验证明，用AFP致敏的DC可抑制肝细胞癌的生长，且对正常肝细胞的再生没有影响[5]。我们应用的CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群高数量细胞群，单个疗程可达1×109个，CIK兼具有淋巴细胞强大的杀瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合体限制性杀瘤特点。它是迄今发现的所有免疫效应细胞中，增殖能力最强、细胞毒活性较强的细胞。DC和CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，二者联合可以有效提高机体的免疫功能，改善生存质量，延长生存期，同时增加化疗敏感性，降低化疗不良反应。以往认为化疗主要对机体产生免疫抑制的负面影响。然而，近几年来借助新的研究技术和较理想的动物模型，对化疗和免疫反应的相互作用有了更深入的了解，认为化疗对肿瘤的免疫功能存在双重的影响。而替吉奥为氟尿嘧啶类的氟化物，通过在体内转化为5-FU，可作为一种免疫调节剂，5-FU通过诱导肿瘤细胞的抗原及MHC分子的表达，从而恢复CTL对靶细胞的特异性杀伤活性。通过选择性清除MDSCs（Myeloid-derived suppessor cells 髓系来源抑制细胞），提高后续免疫治疗的疗效。本研究发现，通过应用自体DC-CIK联合替吉奥治疗，中晚期肝癌患者CD3+T淋巴细胞、CD4+Th细胞、CD4/CD8比率都有不同程度的增加，呈显著性差异（p<0.05）。说明DC-CIK能够增强机体的细胞免疫功能，改善机体的免疫抑制状态，这与文献报道一致[6]本研究结果还发现，经过积极的DC-CIK联合替吉奥治疗后，患者的体能状况KPS评分有所提高，总得提高率为90.5%，并且在临床症状方面，明显改善患者的疲乏、食欲不振、腹胀等症状。虽有部分患者有出现白细胞减少、消化道等不良反应，但都比较轻微，经短期处理后均可缓解。
综上所述，自体免疫细胞DC-CIK联合替吉奥治疗中晚期肝癌，具有较好的抗肿瘤作用及轻微的毒副反应，改善患者生活质量，安全性高，是中晚期肝癌治疗的新选择。但本研究的病例数较少，观察时间短，未能随访到生存时间，其临床效果尚需大样本前瞻性、对照的临床试验来进一步证实。
参考文献
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