【摘 要】目的：研究肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌中的表达，探讨XAF1在肺腺癌耐药发生、发展中的作用，为基因治疗耐药肺腺癌提供理论依据。方法：本研究培养人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP和其亲本株A549，通过MTT法测定A549/DDP对顺铂的耐药指数；采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测两种细胞及凋亡细胞（顺铂作用48h后的A549细胞）中XAF1、XIAP mRNA的表达水平变化。结果：A549和A549/DDP细胞对顺铂的IC50分别为5.52±0.12µmol/L、34.96±0.74µmol/L，因此，A549/DDP对顺铂的耐药指数为34.96/5.52=6.33，确定为耐顺铂的非小细胞肺癌细胞；RT-PCR结果显示A549/DDP细胞较正常A549细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05），正常A549细胞组较凋亡细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05）；XIAP mRNA的表达A549/DDP细胞组明显高于凋亡细胞（P<0.01），且A549/DDP细胞组XIAP mRNA的表达高于正常A549细胞组（P<0.05），正常A549细胞组XIAP mRNA的表达高于凋亡细胞（P<0.05）。 结论：顺铂耐药肺腺癌细胞株中肿瘤抑制基因XAF1表达降低或缺如，XIAP基因表达明显增强，XAF1、XIAP作为凋亡相关基因现已被肯定，XAF1在肺腺癌顺铂耐药过程的发生、发展中可能起一定作用。
【关键词】人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP；XIAP相关因子1；细胞凋亡
【中图分类号】R655 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0038-02
材料与方法
一、材料
人非小细胞肺癌A549细胞株属我院实验室保存，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞A549来源于ATCC）；DDP购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号H20023460）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；Trizol试剂（Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
二、方法
1 细胞培养 人非小细胞肺癌A549细胞培养在DMEM（含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）培养液中，人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞培养在含有2mg/L DDP的DMEM培养基中，置37℃、饱和湿度、含5%C02和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期传代，进行试验前1周更换为不含DDP的DMEM培养基以减少DDP对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞。
2 MTT法测定A549/DDP细胞的耐药指数 取对数生长期的A549和A549/DDP细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度接种于无菌96孔板中，每孔200ul（细胞数约为5×103）。每组设6个复孔。根据预实验结果，A549细胞分别加入DDP终浓度为0µmol/L、1.25µmol/L、2.5µmol/L、5µmol/L、7.5µmol/L、10µmol/L的DMEM培养基，A549/DDP细胞分别加入DDP终浓度为0µmol/L、10µmol/L、20µmol/L、30µmol/L、40µmol/L、50µmol/L的DMEM培养基，继续培养，每24h换液一次，浓度同前，培养至44小时时取出96孔板，根据试剂盒说明书行MTT检测，并计算不同浓度的DDP对A549细胞和A549/DDP细胞的生长抑制率。然后根据SPSS17.0软件得出A549细胞和A549/DDP细胞对DDP的IC50值。耐药指数又称耐药倍数，指耐药细胞对某种药物的半数抑制浓度（IC50）除以敏感细胞的半数抑制浓度，本研究中即耐药细胞A549/DDP对DDP的IC50/敏感细胞A549对DDP的IC50。
3 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测A549和A549/DDP细胞中XAF1、XIAP基因的表达
参照Trizol试剂盒说明书提取两种细胞的总RNA，取终浓度为2.5µmol/L的DDP作用48h之后的A549细胞作为对照组，按RT-PCR试剂盒说明书操作。XAF1引物序列：正义5’-GAGGAGATAAAGCAGCCTATGAC-3’反义5’-CTCTTGCCTGATTGCTGTGG-3’XIAP引物序列：正义5’-TACAGGCATGCTCCACGGTG-3’反义5’-TCCTGCCTCAGTCGCTCTAG-3’β-actin引物序列：正义5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’反义5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’。 应用Kodak凝胶数据分析系统对PCR产物电泳带进行扫描拍摄，测定各目的基因和beta-actin扩增产物的光密度值（OD值），利用PCR软件分析，计算目的条带与内参条带的峰面积值比值表示转录水平，进行半定量分析。
三、统计学处理
每组实验最少重复三次.所有数据分析均采用SPSS17.0统计软件包完成。所有计量资料的检测结果以均数±标准差（±s）表示，根据直线回归计算两种细胞对药物的IC50，两个均数比较用ANOVA检验，XAF1 mRNA表达两组间的比较采用单因素方差分析，检验水准取P<005为有统计学差异。
结果
一、顺铂对A549和A549/DDP细胞增殖的影响（见表1、2），结果表明：顺铂对A549细胞的增殖有明显的抑制作用，且抑制效果呈浓度依赖性，随着顺铂浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549细胞48小时的半数抑制浓度IC50为5.52±0.12µmol/L；顺铂对A549/DDP细胞也有一定的增殖抑制作用，但较A549细胞有明显的耐受，随着药物浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549/DDP细胞48小时的半数抑制浓度IC50为34.96±0.74µmol/L。
A549/DDP细胞对DDP的耐药指数=顺铂对A549/DDP细胞的IC50/顺铂对其亲本敏感细胞株A549细胞的IC50，即34.96µmol/L /5.52µmol/L=6.33。所以A549/DDP细胞确定为耐顺铂的肺癌细胞株，适合进行进一步的肺癌耐药相关机制研究。
表1 顺铂对A549细胞的增殖的影响（x±s，n=6）
浓度0µmol/L1.25µmol/L2.5µmol/L5µmol/L7.5µmol/L10µmol/L
OD值1.013±0.0120.901±0.0160.800±0.0250.473±0.0170.302±0.0140.087±0.011
IR（%）011.04±0.0221.01±0.0353.33±0.0270.19±0.0291.41±0.01
表2 顺铂对A549/DDP细胞的增殖的影响（x±s，n=6）
浓度0µmol/L10µmol/L20µmol/L30µmol/L40µmol/L50µmol/L
OD值1.041±0.0150.851±0.0080.705±0.0160.582±0.0130.383±0.0170.265±0.016
IR（%）018.25±0.0132.26±0.0244.09±0.0163.20±0.0274.55±0.02
二、RT-PCR检测A549及A549/DDP细胞的XAF1、XIAP mRNA表达情况
RT-PCR结果显示：A549/DDP细胞组较正常A549细胞组XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05），正常A549细胞组较顺铂作用48h后的A549细胞组XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05）；XIAP mRNA的表达A549/DDP细胞组明显高于顺铂作用后的A549细胞（P<0.01），且A549/DDP细胞组XIAP mRNA的表达高于正常A549细胞组（P<0.05），正常A549细胞组XIAP mRNA的表达高于顺铂作用后的A549细胞（P<0.05）。（见图1）
图1 各组细胞中XAF1、XIAP mRNA表达电泳图
A：凋亡细胞（顺铂作用后的A549细胞）B. A549细胞C：A549/DDP细胞
讨 论
近年来对肺癌实施的以顺铂（cisplatin，DDP）为主的联合化疗方案的多学科综合治疗，尽管已经取得了一定的疗效，然而，由于铂类耐药的发生，常常导致肺瘤化疗的失败，限制了铂类药物的广泛应用。肿瘤细胞的耐药机制目前尚未完全清楚，一般认为与细胞周期及凋亡异常有一定关系。
随着基因技术的高速发展，肿瘤细胞凋亡研究中的一个重要发现是鉴定了一组与细胞凋亡抑制有关的蛋白家族，即凋亡抑制蛋白家族（IAPs），XIAP相关因子1（XIAP-associated factor 1，XAF1）是一个应用酵母双杂交法发现的新的XIAP拮抗蛋白，它直接与XIAP结合并抑制XIAP的抗凋亡作用。XAF1基因的失活可能与多种肿瘤的发生、发展关系密切，国内外已对XAF1基因进行了大量临床和基础研究，但在与肺癌耐药的发生发展的关系中该基因深入研究尚未见报道。本研究结果表明，A549/DDP细胞为耐药的细胞株，符合实验条件。耐药的肺腺癌细胞中XAF1基因表达较正常A549细胞减少，较凋亡的细胞减少更加明显，因此不仅说明XAF1基因与细胞的凋亡有关，XAF1蛋白的低表达或表达缺失是肺癌发生的早期分子事件，随着癌细胞分化程度的下降，XAF1蛋白的阳性表达率也逐渐下降，也说明XAF1基因与肺癌细胞的耐药发生有一定的关系，虽然不能证实XAF1基因直接参与了肿瘤细胞耐药的发生，但却表明XAF1表达降低或缺失在肺癌耐药发生、发展中起着重要作用，为研究肺癌耐药的发生、发展提供了新的理论依据，也为逆转肿瘤耐药提供了新的基因靶点。
参考文献：
[1] 盛桂凤，毕廷智，刘永萍，等. XRCC1与晚期非小细胞肺癌含铂类药物化疗疗效的关系[J]. 江苏医药，2013，39（3）：295-297.
[2] 郭旭峰， 陈勇兵， 徐中华， 等. 凋亡抑制基因XIAP和PED/PEA-15与老年肺癌发生、发展的关系. 中国老年学杂志， 2008， 28（5）：481-483. 【摘 要】目的：研究肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌中的表达，探讨XAF1在肺腺癌耐药发生、发展中的作用，为基因治疗耐药肺腺癌提供理论依据。方法：本研究培养人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP和其亲本株A549，通过MTT法测定A549/DDP对顺铂的耐药指数；采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测两种细胞及凋亡细胞（顺铂作用48h后的A549细胞）中XAF1、XIAP mRNA的表达水平变化。结果：A549和A549/DDP细胞对顺铂的IC50分别为5.52±0.12µmol/L、34.96±0.74µmol/L，因此，A549/DDP对顺铂的耐药指数为34.96/5.52=6.33，确定为耐顺铂的非小细胞肺癌细胞；RT-PCR结果显示A549/DDP细胞较正常A549细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05），正常A549细胞组较凋亡细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05）；XIAP mRNA的表达A549/DDP细胞组明显高于凋亡细胞（P<0.01），且A549/DDP细胞组XIAP mRNA的表达高于正常A549细胞组（P<0.05），正常A549细胞组XIAP mRNA的表达高于凋亡细胞（P<0.05）。 结论：顺铂耐药肺腺癌细胞株中肿瘤抑制基因XAF1表达降低或缺如，XIAP基因表达明显增强，XAF1、XIAP作为凋亡相关基因现已被肯定，XAF1在肺腺癌顺铂耐药过程的发生、发展中可能起一定作用。
【关键词】人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP；XIAP相关因子1；细胞凋亡
【中图分类号】R655 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0038-02
材料与方法
一、材料
人非小细胞肺癌A549细胞株属我院实验室保存，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞A549来源于ATCC）；DDP购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号H20023460）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；Trizol试剂（Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
二、方法
1 细胞培养 人非小细胞肺癌A549细胞培养在DMEM（含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）培养液中，人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞培养在含有2mg/L DDP的DMEM培养基中，置37℃、饱和湿度、含5%C02和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期传代，进行试验前1周更换为不含DDP的DMEM培养基以减少DDP对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞。
2 MTT法测定A549/DDP细胞的耐药指数 取对数生长期的A549和A549/DDP细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度接种于无菌96孔板中，每孔200ul（细胞数约为5×103）。每组设6个复孔。根据预实验结果，A549细胞分别加入DDP终浓度为0µmol/L、1.25µmol/L、2.5µmol/L、5µmol/L、7.5µmol/L、10µmol/L的DMEM培养基，A549/DDP细胞分别加入DDP终浓度为0µmol/L、10µmol/L、20µmol/L、30µmol/L、40µmol/L、50µmol/L的DMEM培养基，继续培养，每24h换液一次，浓度同前，培养至44小时时取出96孔板，根据试剂盒说明书行MTT检测，并计算不同浓度的DDP对A549细胞和A549/DDP细胞的生长抑制率。然后根据SPSS17.0软件得出A549细胞和A549/DDP细胞对DDP的IC50值。耐药指数又称耐药倍数，指耐药细胞对某种药物的半数抑制浓度（IC50）除以敏感细胞的半数抑制浓度，本研究中即耐药细胞A549/DDP对DDP的IC50/敏感细胞A549对DDP的IC50。
3 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测A549和A549/DDP细胞中XAF1、XIAP基因的表达
参照Trizol试剂盒说明书提取两种细胞的总RNA，取终浓度为2.5µmol/L的DDP作用48h之后的A549细胞作为对照组，按RT-PCR试剂盒说明书操作。XAF1引物序列：正义5’-GAGGAGATAAAGCAGCCTATGAC-3’反义5’-CTCTTGCCTGATTGCTGTGG-3’XIAP引物序列：正义5’-TACAGGCATGCTCCACGGTG-3’反义5’-TCCTGCCTCAGTCGCTCTAG-3’β-actin引物序列：正义5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’反义5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’。 应用Kodak凝胶数据分析系统对PCR产物电泳带进行扫描拍摄，测定各目的基因和beta-actin扩增产物的光密度值（OD值），利用PCR软件分析，计算目的条带与内参条带的峰面积值比值表示转录水平，进行半定量分析。
三、统计学处理
每组实验最少重复三次.所有数据分析均采用SPSS17.0统计软件包完成。所有计量资料的检测结果以均数±标准差（±s）表示，根据直线回归计算两种细胞对药物的IC50，两个均数比较用ANOVA检验，XAF1 mRNA表达两组间的比较采用单因素方差分析，检验水准取P<005为有统计学差异。
结果
一、顺铂对A549和A549/DDP细胞增殖的影响（见表1、2），结果表明：顺铂对A549细胞的增殖有明显的抑制作用，且抑制效果呈浓度依赖性，随着顺铂浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549细胞48小时的半数抑制浓度IC50为5.52±0.12µmol/L；顺铂对A549/DDP细胞也有一定的增殖抑制作用，但较A549细胞有明显的耐受，随着药物浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549/DDP细胞48小时的半数抑制浓度IC50为34.96±0.74µmol/L。
A549/DDP细胞对DDP的耐药指数=顺铂对A549/DDP细胞的IC50/顺铂对其亲本敏感细胞株A549细胞的IC50，即34.96µmol/L /5.52µmol/L=6.33。所以A549/DDP细胞确定为耐顺铂的肺癌细胞株，适合进行进一步的肺癌耐药相关机制研究。
二、RT-PCR检测A549及A549/DDP细胞的XAF1、XIAP mRNA表达情况
RT-PCR结果显示：A549/DDP细胞组较正常A549细胞组XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05），正常A549细胞组较顺铂作用48h后的A549细胞组XAF1 mRNA表达水平下调（P<0.05）；XIAP mRNA的表达A549/DDP细胞组明显高于顺铂作用后的A549细胞（P<0.01），且A549/DDP细胞组XIAP mRNA的表达高于正常A549细胞组（P<0.05），正常A549细胞组XIAP mRNA的表达高于顺铂作用后的A549细胞（P<0.05）。（见图1）
讨 论
近年来对肺癌实施的以顺铂（cisplatin，DDP）为主的联合化疗方案的多学科综合治疗，尽管已经取得了一定的疗效，然而，由于铂类耐药的发生，常常导致肺瘤化疗的失败，限制了铂类药物的广泛应用。肿瘤细胞的耐药机制目前尚未完全清楚，一般认为与细胞周期及凋亡异常有一定关系。
随着基因技术的高速发展，肿瘤细胞凋亡研究中的一个重要发现是鉴定了一组与细胞凋亡抑制有关的蛋白家族，即凋亡抑制蛋白家族（IAPs），XIAP相关因子1（XIAP-associated factor 1，XAF1）是一个应用酵母双杂交法发现的新的XIAP拮抗蛋白，它直接与XIAP结合并抑制XIAP的抗凋亡作用。XAF1基因的失活可能与多种肿瘤的发生、发展关系密切，国内外已对XAF1基因进行了大量临床和基础研究，但在与肺癌耐药的发生发展的关系中该基因深入研究尚未见报道。本研究结果表明，A549/DDP细胞为耐药的细胞株，符合实验条件。耐药的肺腺癌细胞中XAF1基因表达较正常A549细胞减少，较凋亡的细胞减少更加明显，因此不仅说明XAF1基因与细胞的凋亡有关，XAF1蛋白的低表达或表达缺失是肺癌发生的早期分子事件，随着癌细胞分化程度的下降，XAF1蛋白的阳性表达率也逐渐下降，也说明XAF1基因与肺癌细胞的耐药发生有一定的关系，虽然不能证实XAF1基因直接参与了肿瘤细胞耐药的发生，但却表明XAF1表达降低或缺失在肺癌耐药发生、发展中起着重要作用，为研究肺癌耐药的发生、发展提供了新的理论依据，也为逆转肿瘤耐药提供了新的基因靶点。
参考文献：
[1] 盛桂凤，毕廷智，刘永萍，等. XRCC1与晚期非小细胞肺癌含铂类药物化疗疗效的关系[J]. 江苏医药，2013，39（3）：295-297.
[2] 郭旭峰， 陈勇兵， 徐中华， 等. 凋亡抑制基因XIAP和PED/PEA-15与老年肺癌发生、发展的关系. 中国老年学杂志， 2008， 28（5）：481-483.