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【摘 要】 目的:探讨抑郁症患者脑脊液蛋白组学表达的差异蛋白。方法:本研究为对照研究。研究对象是符合中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD-3)抑郁症诊断标准的8例门诊首发抑郁症患者和8例正常对照。提取研究对象的脑脊液后,应用比较蛋白组学技术分析脑脊液蛋白,所得凝胶经银染和考染后,应用ImageMaster 5.0软件对图像进行分析。结果:脑脊液差异蛋白点的初步分析显示,与对照组比较,抑郁症患者脑脊液中Apo D(丰度比值0.022 vs.0.321)和血浆视黄醇结合蛋白(0.032 vs.0.541)2种蛋白表达下调,而Apo A-Ⅰ(0.556 vs.0.020)1种蛋白表达上调。结论:抑郁症患者脑脊液上述3种蛋白的差异表达可能与抑郁症的发生有关,有可能为治疗寻找新的靶点。
【关键词】 脑脊液;双向凝胶电泳;抑郁症;蛋白质组学;对照研究
中图分类号: R749.4,R446.14 文献标识码: A 文章编号:1000-6729(2010)009-0665-04
doi:10.3969/j.issn.1000-6729.2010.09.007
抑郁症是一种高患病率的精神疾病,临床表现为复杂多变的躯体症状和情感障碍,其病因不清,寻找与病因有关的生物学标记物是精神、心理医生关心的问题。人脑脊液含有极微量的蛋白质,其中绝大部分为白蛋白,球蛋白极微。在发生某些疾病时,脑脊液中蛋白质可发生不同程度的种类和数量的变化。脑脊液临床易获得,利用比较蛋白质组学(Comparative proteomics)技术可鉴定不同状态下各种脑脊液样本之间蛋白质表达的差异,有助于疾病的早期诊断、寻找新的药物靶点。近年来国外已经应用蛋白组学技术对神经系统疾病患者,如多发性硬化、Alzheimer病、帕金森病等[1]患者的脑脊液行特异性蛋白标志物检测,探索疾病的发病机制,寻找理想的生物标志物。目前国内尚未见到抑郁症患者脑脊液的蛋白组学研究。本研究目的是应用人脑脊液比较蛋白组学技术去寻找抑郁症患者脑脊液中的差异蛋白。
1 对象与方法
1.1 对象
1.1.1抑郁症组
该组人员是2007年7月~2008年8月解放军总医院神经内科门诊就诊的抑郁症患者。入组标准:(1)首次发病,病程在1年以上;(2)符合中国精神障碍分类与诊断标准(CCMD-3)抑郁症诊断标准;(3)汉密顿抑郁量表17项(Hamilton Depression Scale,HAMD-17)评分>17分;(4)入组前未服用抗抑郁剂、情感稳定剂、精神病药物治疗;(4)患者及家属签署知情同意。排除标准:(1)合并脑器质性疾病及脑外伤;(2)合并严重躯体疾病;(3)合并其他类型精神疾患;(4)尿妊娠试验阳性和哺乳期女性。共入组8例,其中男性4例,女性4例,年龄20~42岁,平均(29.9±7.3)岁。
1.1.2 对照组
该组人员是同期在解放军总医院神经内科门诊就诊的头痛患者,因新发头痛为排除神经系统器质性病变进行腰穿检查。所有患者既往无特殊疾病史,查体无神经系统阳性体征,经头颅CT和/或MRI检查未发现异常,均行汉密顿抑郁量表17项检查,排除抑郁症。所有患者头痛均于1天内自行缓解,可作为正常对照组。共入组8例,其中男性4例,女性4例,年龄23~41岁,平均(32.3±6.9)岁。
项目实施前通过中国人民解放军总医院伦理委员会批准,所有入组患者和对照组参与前签署知情同意书。
1.2 工具
应用采用汉密顿抑郁量表(HAMD)[2],由2名心理科主治医师以上职称人员评定患者的抑郁症状,经量表评定一致性培训,Kappa=0.812。
1.3 方法
1.3.1获取标本
经患者和家属签署腰穿检查知情同意书后,于上午9:00在局麻下行腰穿检查。常规行脑脊液常规和生化检查,余4 mLCSF立即在8000 r/min、4 ℃下离心10 min,去除其他细胞和杂质,1 mL/管分装,将样品-70 ℃冰箱储存。
1.3.2试剂和仪器
主要试剂有硝酸银、考马斯亮蓝R250、Amicon Ultra-15离心滤器(5KD Millipore公司)、线性固相PH梯度预制胶条(18 cm,PH4-7,Pharmacia Biotech公司)、去白蛋白、IgG试剂盒(Merck公司)、IPG Buffer(PH 4-7 Pharmacia Biotech公司)。主要仪器有:UV-160A紫外分光光度计(日本)、高速冷冻离心机(德国 MIKRO 22R)、固相PH梯度等电聚焦仪(Pharmacia Biotech 公司)、垂直电泳仪(Bio-Rad 公司),图像扫描仪。
1.3.3脑脊液蛋白的提取、去高峰度蛋白
8例病例组各取2 mL脑脊液,共16 mL,常温融化,置于离心滤器中,20 ℃、12000 r/min,离心40 min、共2次,得到浓缩脑脊液约300 μL,用1.5 mL缓冲液稀释,按照去白蛋白、IgG试剂盒说明书操作,去除白蛋白和IgG。共得到4 mL稀释液,加入10 mL裂解液,20 ℃、14000 r/min,离心40 min、共2次,得到浓缩脑脊液约500 μL。
1.3.4蛋白定量
应用Bradford法[3]。
1.3.5第一向固相PH梯度等电聚焦电泳
取23 μL样品加318.25 μL重泡胀液,加7 μL DTT,加1.75 μIPG Buffer,振荡混匀、离心。将混合液加入胶槽中,用镊子取PH 4-7、18 cm长的IPG胶条,揭下保护膜,放入胶槽中,覆盖矿物油。盖上胶条盖,等电聚焦仪跑胶,重泡胀1 h,跑胶30 V 10 h,500V 0.5 h,8000V 20 h,至总伏时达80000伏时。
1.3.6第二向垂直平板SDS-PAGE电泳
将已平衡好的IPG胶条置于第二向凝胶,胶面向上,酸性端在左侧,碱性端在右侧,排除气泡,使两者紧密结合,Marker与胶条平行放置。用0.5%琼脂糖溶液封胶,放入电泳槽,加入电泳液,接通电源,每块胶设为20 mA,40 min,30 mA,6 h,16 ℃循环冷却水冷却,待溴酚蓝前沿到达玻璃板下缘,停止电泳。
1.3.7考马斯亮蓝染色
取出凝胶,固定液固定10 min,90 ℃,考染液染色15 min,脱色液过夜。
1.3.8银染
取出凝胶板,固定液中30 min,敏化液30 min,双蒸水200 mL洗3次,每次5 min,银染液避光染色20 min,双蒸水200 mL洗30 s,显色液显色5~10 min,终止液终止染色10 min,双蒸水过夜。
1.3.9图像扫描和分析
扫描仪扫描凝胶,后应用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对图像进行分析。通过设定检测参数,特别是优化smooth参数,以便检测出所有真实的蛋白点和劈开重叠的蛋白点。通过改变saliency和min area值过滤掉干扰噪音,自动进行点检测(spot detection)、量化、背景消除。通过手工标记取点进行增加点、删除点、劈开点,获得蛋白点检测图。通过对marker蛋白的标记和pH值的标记,可获得蛋白点的pI(isoelectric point 等电点)值和MW(molecular weight 分子量)值。以正常对照组为参考凝胶(refrence gel),抑郁症组凝胶图谱与之进行配比,最后获得凝胶分析报告。通过对该点占整个凝胶浓度的比值(Ratio)计算,按照表达差异大于3倍确定为有意义的差异蛋白点。
1.3.10蛋白点的初步分析
根据凝胶分析报告中获得的等电点(pI)和分子量(MW),利用互联网上的蛋白质搜索网址(http:∥.cn/qkimages//zxws/zxws201009/zxws20100907-1-l.jpg" hspace="15" vspace="5" align="">
3 讨 论
脑脊液存在于脑室系统,被认为是脑和脊髓的淋巴,与脑组织直接接触。脑组织的生化、代谢变化可通过脑脊液得到体现。抑郁症是一种常见的心境障碍,可由各种原因引起,以显著而持久的心境低落为主要临床特征,尸检研究发现抑郁症患者海马、胼胝体膝下区、眶回、背侧前额叶和杏仁核等部位的皮质容量、神经元、胶质细胞数量减少;还发现皮层一些区域神经元体积也减小,如带状皮层前部神经元体积减小约23%。提示抑郁症患者有神经系统器质性病变[5]。传统方法仅限于对个别蛋白质表达的探讨,蛋白质组学技术对有关蛋白质的数量、结构、性质、相互作用和生物学功能进行全面的认识和深入的研究,对抑郁症的病因、发病机制、病理生理过程、生化改变,寻找新的药物靶点都有巨大帮助,已成为疾病研究的新方向和方法。
本文应用脑脊液比较蛋白组学的方法,通过对抑郁症和正常对照组脑脊液的2-DE比较,在银染胶中发现Apo D、血浆视黄醇结合蛋白下调,而Apo A-Ⅰ上调。血清中的视黄醇结合蛋白在急性感染时降低,且降低的程度与感染的轻重成正比。Puchades等[6]研究在额颞痴呆患者的脑脊液中视黄醇结合蛋白降低提示额颞痴呆可能与炎症有关。本研究中显示视黄醇结合蛋白降低,考虑抑郁症的发生和发展可能与炎症有关。人类的大脑中已发现载脂蛋白A-I、A-IV、D、E、J[7-8],其功能与脑内的脂代谢有关,Yang等[9]应用2-DE联合MALDI-TOF-MS方法对8例经病理证实的难治性中央颞叶癫痫(MTLE)患者和8例正常对照组的海马进行研究,发现海马中Apo A-I的含量是正常对照组的7.5倍(P=0.003)。Apo A-I是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分,对保持HDL的结构完整性保持重要的作用。人们已经在人脑组织和脑脊液中发现Apo A-I的存在和改变[10],有明确证据证明Apo A-I与脂质代谢、细胞胆固醇的稳态、调节免疫系统有关,甚至还可能与脑神经的变性和再生有关[11-12]。本研究在抑郁症患者脑脊液中发现Apo A-I的变化,强烈支持抑郁症的神经元与胶质细胞变化的假说。尽管Apo D能和胆固醇、孕酮、胆固醇、花生四烯酸结合,但不能代表其生理学的配基。在周围神经损害部位和Alzheimer"s 病患者的脑脊液中Apo D均有升高[13],因此考虑其功能为在中枢和周围神经系统内起保护和修复作用[14]。本研究发现在抑郁症患者的脑脊液中载脂蛋白D有改变,说明在抑郁症患者伴着神经元的变性和免疫异常。
综上所述,抑郁症患者CSF中上述3种蛋白的差异表达可能与抑郁症的发生有关,有可能为治疗寻找新的药物靶点。
参考文献
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编辑:岳伟华
2009-09-10收稿,2010-03-01录用