鉴定。方法以HepG2和SMMC-7721兩种人源肝癌细胞为筛选混合靶标，利用细胞指数富集的配基系统进化（Cell-SELEX）技术筛选获得核酸适配体。利用流式细胞术检测文库富集情况，将富集文库进行克隆、测序，应用RNA structure、MEME在线软件进行序列分析，再次通过流式细胞术鉴定核酸适配体与靶标的结合能力及特异性。结果通过10轮Cell-SELEX筛选得到核酸适配体10-8，流式细胞术检测显示核酸适配体10-8与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞结合，且特异性靶向肝癌细胞。结论筛选获得与人源肝癌细胞系HepG2 和SMMC-7721双靶标特异性结合的核酸适配体10-8。
[关键词]细胞指数富集的配基系统进化技术;癌，肝细胞;分子靶向治疗;适体，核苷
[中图分类号]R34[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2019）03-0303-05
[ABSTRACT]ObjectiveTo perform the screening and identification of specific aptamers targeting both HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells. MethodsCell-SELEX was used to screen out the aptamers targeting both human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells. Flow cytometry was used to evaluate the eichment of pools， and the eiched pool was then cloned and sequenced. RNA structure and MEME online software were used for sequence analysis， and flow cytometry was used to identify the binding capacity and specificity of candidate aptamers to targets. ResultsThe aptamer 10-8 was obtained after 10 rounds of Cell-SELEX. Flow cytometry showed that the aptamer 10-8 was bound to human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cell lines and specifically targeted hepatoma cells. ConclusionThe aptamer 10-8 specifically binding to human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells is obtained.
[KEY WORDS]Cell-SELEX; carcinoma， hepatocellular; molecular targeted therapy; aptamers， nucleotide
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的主要原因之一，对人类健康和生命构成极大威胁[1-2]。据全球癌症数据调查显示，中国肝癌病人数约占全球的50%[3-4]，肝细胞癌占原发性肝癌的70%～90%[5]。目前，肝癌治疗的方法主要为手术切除、放疗、化疗以及几种治疗方法的联合治疗[6-7]。手术切除不彻底、复发率高和转移率高等是影响肝癌治疗效果的主要问题[8-9]。因此，从分子水平上发展分子靶向药物及免疫治疗药物，可以大大提高肝癌病人的治疗效果[10-11]。核酸适配体是一类具有特定结构的单链DNA或RNA，其长度一般为20～80个碱基[12-13]。利用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术，可以从随机单链核酸序列库中筛选出与靶标特异性结合的核酸适配体[14]，而Cell-SELEX是在SELEX基础上发展而来，以细胞为靶标筛选获得核酸适配体的技术[15]。核酸适配体与抗体作用相似，但又优于抗体[16]。高特异性、高亲和力的适配体具有靶分子范围广、性质稳定、制备方便、无免疫原性、成本低、便于保存运输、易在体外化学合成等优点[17-19]，为恶性肿瘤的早期诊断和治疗、肿瘤标志物的筛选提供了一种全新有效的方法和手段[20]。目前，以肝癌细胞为靶标进行的适配体筛选均是以单一的某一种肝癌细胞为靶标，尚未见以两种或多种细胞为靶标进行的适配体筛选的报道。本研究以HepG2、SMMC-7721两种肝癌细胞作为混合靶标，应用Cell-SELEX技术筛选特异性核酸适配体，期望获得能靶向两种肝癌细胞的核酸适配体，从而建立获得广泛靶向肝癌细胞靶标的方法。同时，本文自适配体筛选第4轮结束后引入人源永生化正常肝细胞系L-02进行消减筛选，排除适配体对正常细胞的影响，为后期通过适配体载药进行肝癌的基因治疗时，更有效地减小毒副作用、提高肿瘤部位的局部药物浓度奠定基础。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞筛选靶细胞采用人源肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721（青岛大学附属医院中心实验室提供）;消减筛选细胞为人源永生化正常肝细胞系L-02（购自中国科学院上海细胞库）;特异性检测细胞包括人源永生化乳腺细胞系HBL100、人源乳癌细胞MCF-7、人源大细胞性肺癌细胞H460、人结直肠腺癌细胞SW480及人源胃癌细胞MGC-803（青岛大学附属医院中心实验室提供）。以上细胞均采用含体积分数0.10胎牛血清（美国Gibco公司）的高糖DMEM培养基（美国Hyclone公司）培养。