不对称PCR的引物浓度优化及在柑橘基因型分析上的应用

鉴定的可行性。以上试验结果表明，不对称PCR可以用于单链产物扩增，也可以用于部分柑橘品种区分、等位基因分析及目标片段的基因型鉴定。

不对称PCR反应扩增长度有限，在多次试验中，目标片段长度在500 bp以上的结果均不理想，因此利用普通Taq酶进行不对称PCR时，所扩增的目的片段长度不宜过长，一般宜控制在500 bp以下。而研究长片段时，宜改用或改进试验方法，Sofia等在研究欧洲栗内切β-1，3-葡聚糖酶基因的一段片段（1 231 bp）时，就改用了不对称巢式PCR技术，采用多个引物进行研究[10]。此外，用其他方法可以对引物进行常规预扩增，产物经PAGE检测目标双链仅1条带，无杂带干扰，以获得带型简单易于分析的结果。从本试验结果比较可见，不同引物的PCR效率是不同的，甚至模板也能影响引物的扩增效率，因此必要时可以对引物进行初步筛选或结合其他方式进一步分析，Gruz等利用不对称PCR技术结合熔解曲线分析能够对单核苷酸多态性进行高通量的基因分型[11]。

常规的PCR条件下，不对称PCR所使用的引物的量不同，一次PCR所获得单链产物较少，要获得更多单链产物，模板浓度应足够大，或进行二次PCR。尽管曾鸿普等一次不对称PCR就得到了较为清晰的结果[12]，但在试验过程中发现，第1次PCR产物稀释100～200倍后作为二次PCR的模板进行不对称PCR，不仅大大减少了模板用量，而且带型清晰、易于分析，结果更为理想。

单侧引物浓度不变，另一侧引物稀释为原浓度的1/10后进行不对称PCR，目标双链和单链产物带清晰，浓度比例较为适当，也说明二次不对称PCR同时使用上下游引物更容易获得高浓度的dsDNA。此外，本试验结果表明单链产物在利用单链构象多态性进行凝胶检测时，单链在凝胶上所体现的形式因单链产物及其自身所形成的构象不同而可能有多种，因此基于SSCP的产物检测应注意在相同条件下进行多重比较，以避免误判，方能获得更为可靠的分析结果。

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