打开文本图片集
摘 要 目的：建立中药抗菌药物紫苏方胶囊微生物限度检查方法并对其进行验证。方法：参照2015年版《中国药典》四部通则，利用卵磷脂、L组氨酸、聚山梨酯80的中和作用，采用薄膜过滤法和平皿法测定紫苏方胶囊对金黄色葡萄球菌等5种试验菌种的回收率，并对其进行了控制菌适用性试验。结果：5种试验菌回收率均在0.5～2.0范围，控制菌可检出。结论：本试验所建立方法可用于紫苏方胶囊的微生物限度检查。
关键词 紫苏方 验证 微生物限度试验
中图分类号：R286； R927.11 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）13-0080-04
Verification of microbial limit test method for Zisu Fang
ZHANG Yuanyuan1，2*， CAO Xiankai2， LI Xiaobo1**
（1. Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China；
2. Shanghai Lvgushengmingyuan Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）
ABSTRACT Objective： To establish and verify the microbial limit test method for the traditional Chinese medicine of Zisu Fang capsule. Methods： According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles， the recovery rates of Zisu Fang capsule against 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus were measured by membrane filtration and Petri dish methods and using the neutralization of lecithin， L-histidine and polysorbate 80， and the applicability test of E.coli as the control bacterium was also performed. Results： The recovery rates of the 5 kinds of experimental microorganisms were in the range of 0.5～2， and the control bacterium could be detected. Conclusion： The methods established in this experiment can be used for the microbial limit test of Zisu Fang capsule.
KEY WORDS Zisu Fang； verification； microbial limit test
紫蘇方为王永炎院士的临床经验方并由上海绿谷生命园医药有限公司开发为胶囊剂。该方具有清热燥湿、化痰止咳的功效，用于治疗感冒后余邪未净，低热咳嗽，周身不适，食欲不振。该方由紫苏子、紫苏梗、丹参、黄芩、苦参五味药组成，主要药效成分为丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、黄芩苷、苦参碱和氧化苦参碱。药效研究已发现该方具有较强的抗菌活性，其提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性显著，与头孢克洛联用，能增强多种病原微生物对抗生素的敏感度[1-2]。紫苏方微生物限度检查包括需氧菌、霉菌和酵母，控制菌选取大肠埃希菌。中成药组方具有复杂性，任何成分的抑菌成分均可影响微生物限度检查的准确性[3]。所以，对于此类药物，单用稀释和加中和剂的方法很难使试验菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉）的比值都达到药典标准。为保障患者的用药安全，确立可靠的微生物限度检验方法，本试验参照2015年版《中国药典》四部通则1105、1106非无菌产品微生物限度检查微生物计数法、控制菌检查法，对紫苏方胶囊微生物限度检查方法进行了摸索与验证[4]，利用卵磷脂、L-组氨酸、聚山梨酯80的中和作用去除紫苏方胶囊的抑菌性，并采用薄膜过滤法中加入中和剂的方法有效去除抑菌成分。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
紫苏方胶囊（规格0.3 g，批号161102、161103、161105，上海绿谷生命园医药有限公司）。
pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（批号160829，上海中科昆虫生物技术开发有限公司）；大豆卵磷脂、L-组氨酸、聚山梨酯80（批号分别为20160701、20160901、20161201，润捷化学试剂有限公司）。
1.2 培养基与菌种
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基（批号分别为151130、151223、150821、150210、151217、151109，上海中科昆虫生物技术开发有限公司）。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， CMCC（B） 26003）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa， CMCC（B）10104）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis， CMCC（B）-63501）、白色假丝酵母（Candida albicans， CMCC（F）-98001）、黑曲霉（Aspergillus niger， CMCC（F）-98003）和大肠埃希菌（Escherichia coli， CMCC（B）44102）均来自于中国食品药品检定研究院。
1.3 实验仪器
DHG-BH9243Ш电热恒温鼓风干燥箱、SPX-150BS-Ⅱ生化培养箱、MJ-160BS-Ⅱ霉菌培养箱（上海新苗医疗器械有限公司）；Testo 206-pH2酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电气有限公司）；YP1002N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；BSC-1000ⅡA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；YX940D电动吸引器（上海医疗器械公司医用吸引器厂）
1.4 实验方法
参照2015年版《中国药典》四部通则[4]对紫苏方胶囊进行需氧菌总数、真菌总数、控制菌检查方法的确认，其中需氧菌总数采用薄膜过滤法，真菌总数及控制菌检查采用平皿法。
1.4.1 菌液的制备
参照2015年版《中国药典》四部通则[4]1105微生物计数法项下方法制备。
对阳性菌菌液浓度进行稀释，浓度为10-4～10-6，使菌落数不大于100 cfu/ml。
1.4.2 中和剂的制备
取30 g胰酪大豆胨液体培养基，3 g大豆卵磷脂，1 g L-组氨酸，970 ml纯化水加热溶解后，加入30 g聚山梨酯80混合均匀，121 ℃、15 min灭菌后备用（临用新配）。
1.4.3 供试液的制备
取紫苏方胶囊10 g，加中和剂90 ml，于不超过45℃的水浴中放置，混匀，作为1∶10供试液。用中和剂继续稀释，制备1∶100供试液。
1.4.4 计算公式及接受标准
试验组比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数。
中和剂比值=（中和剂对照组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数。
所得比值均应在0.5～2.0范围内。
1.4.5 需氧菌总数计数方法验证
1）需氧菌计数方法的确定（预试验） 以金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌为试验菌。分别采用a，b，c 3种方法对供试品进行处理。①方法a：供试品采用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1 000 ml（最后冲洗100 ml时加入菌悬液）；②方法b：供试品加入中和剂（30 g胰酪大豆胨液体培养基，3 g大豆卵磷脂，1 g L-组氨酸，15 g聚山梨酯80），pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液600 ml（最后冲洗100 ml时加入菌悬液）；③方法c：方法b中聚山梨酯80改为30 g，于45 ℃水浴保温，其余条件不变。
2）方法验证 分别取三批供试品按方法c进行处理，采用薄膜过滤法进行检查。①试验组：取1∶100供试液10 ml，按方法c操作，冲洗时加入0.1 ml菌液，滤干，于TSA上培养；②供试品对照组：不加入菌液的供试液，测定供试品微生物数；③菌液对照组；取稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行回收試验；④中和剂对照组：用中和剂替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行回收试验；⑤阴性对照组：取中和剂10 ml，不加入菌液。
1.4.6 真菌总数计数验证
取三批供试品采用平皿法进行真菌计数的方法学验证及菌落计数。①试验组：取制备好的供试液，加入试验菌液，取1 ml供试液等量分注5个无菌平皿，分别倾注15～20 ml沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养；②供试品对照组：取制备好的供试液，不加入菌液。测定供试品微生物数；③菌液对照组：取稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行回收试验；④中和剂对照组：用中和剂替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行回收试验；⑤阴性对照组：平皿中加入1 ml中和剂，培养。
1.4.7 控制菌验证试验
以大肠埃希菌作为控制菌采用平皿法进行操作，。①试验组：取1∶10供试液10 ml置100 ml TSB中，混匀，同时加入大肠埃希菌菌悬液1 ml混合均匀；②阴性对照组：取TSB 100 ml，不加入样品和菌悬液；③菌液组：取TSB 100 ml加入大肠埃希菌菌悬液1 ml混合均匀。均按药典方法培养，以接入试验组的大肠埃希菌被检出为接受标准。
2 结果
2.1 需氧菌总数计数方法的预实验
三种预实验方法试验结果表明，方法c可用于需氧菌总数计数（表1）。
2.2 需氧菌总数计数方法验证
按照方法c对三批供试品进行验证实验，结果表明采用方法c可用于紫苏方需氧菌总数计数（表2）。
2.3 真菌总数验证试验
采用平皿法对三批供试品进行真菌总数验证，结果表明，可用于紫苏方真菌总数计数（表3）。
2.4 控制菌验证试验
控制菌选用稀释10-4倍的大肠埃希菌，3批供试品试验结果表明，适用性试验符合标准（表4）。
3 讨论
通过上述一系列试验，成功摸索出了适合于具有抑菌作用的紫苏方胶囊的微生物限度控制方法，本次验证试验中需要注意的两点：①中和剂一定要临用现配；②铜绿假单胞菌的计数须在培养24 h内完成，而且试验中贴膜时要用无菌棉花吸干滤膜水分，否则培养后菌落会连成片，无法计数，从而无法对回收率做出判断。
微生物限度检查是判断药品受到微生物污染的程度，是企业从原料到成品生产全过程进行微生物评价的主要依据，同时也是药品安全性检查的重要项目[5-7]。检查方法中干扰因素较多，易影响计数结果，如培养条件、培养基、加菌浓度及加菌量等[8-9]。在新药的研究和开发过程中，建立适当的检验方法学验证必不可少，而且不能简单照搬，需经验证确认试验方法和检测系统的有效性[10-12]。微生物限度检查方法常用的方法有薄膜过滤法（必要时可加入中和剂或稀释培养基）和平皿法。薄膜过滤法是液体类制剂和抑菌作用较强的水溶性药品进行微生物限度试验的首选方法[13-14]。由于本次试验中紫苏方胶囊具有较强的抑菌作用，本文在薄膜过滤法中加入中和剂，摸索了中和剂的比例及对供试液加温等方法，成功去除了供试品的抑菌成分，建立了检查方法，为中药抑菌药物的微生物限度检查方法的建立提供了参考。
参考文献
[1] 刘菁. 紫苏方药物制备物的质量及关联研究[J]. 大家健康（学术版）， 2016， 10（7）： 161-162.
[2] 安琪， 唐雪阳， 卢广英， 等. 紫苏方药物制备物的质量表征及其关联分析[J]. 北京中医药大学学报， 2014， 37（6）： 414-419， 28， 6.
[3] 马越， 特玉香， 杜平华， 等. 16种中成药微生物限度检查法方法验证[J]. 中国药品标准， 2005， 6（6）： 12-15.
[4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015版四部[M].北京： 中国医药科技出版社， 2015： 140-144.
[5] 黄诺嘉. 浅谈中成药微生物限度检查法方法验证存在的几点问题与思考[C]//全国药物质量分析学术研讨会. 北京：中国药学会药物分析杂志， 2006.
[6] 丁勃， 徐曉洁， 刘广桢， 等 双滤膜过滤方法在药品微生物限度检查中的应用研究[J]. 药物分析杂志， 2014， 34（12）： 2229-2234.
[7] 易巧， 刘绪平， 张银花. 药用辅料苯甲醇新版药典微生物限度检查适用性实验[J]. 中国医学创新， 2017， 14（4）： 48-52.
[8] 陈伟盛， 关倩明， 朱荣峰， 等. 药品微生物限度检查中微生物污染的鉴定和溯源分析[J]. 药物分析杂志， 2014， 34（1）： 58-63.
[9] 殷建国. 微生物限度检查应注意的若干问题[J]. 中国药事， 2004， 18（7）： 456.
[10] 曹晓云， 郭艳娟. 药品微生物限度检查方法学验证试验及其相关的技术问题[J]. 天津药学， 2006， 18（6）： 49-51.
[11] 刘文， 张广求， 朱立刚. 2种含碘制剂《中华人民共和国药典》（2015年版）微生物限度检查方法的建立[J]. 中国合理用药探索， 2017， 14（2）： 14-17.
[12] 杨晓莉， 李辉， 马英英， 等. 《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查： 控制菌检查法解读与对策[J]. 中国药师， 2016， 19（4）： 748-752.
[13] 刘戈， 邱唯佳， 费夷敏. 替硝唑栓微生物限度检查方法适用性试验研究[J]. 上海医药， 2016， 37（13）： 73-76.
[14] 殷生楠， 柳冬梅. 8种医院制剂微生物限度检查法验证[J].现代医药卫生， 2010， 28（16）： 2432-2434.