[摘要] 目的 FTIR法用于药品微生物洁净室环境菌的研究，建立药品微生物洁凈室环境菌FTIR光谱库，以快速判断药品检出菌是否为环境菌污染，为药品无菌检查一次检出提供了准确性保证，同时对药品微生物洁净室实现动态监控。方法 用FTIR对洁净室采集的环境菌进行光谱采集，选取特征区3 000～2 800，1 500～1 800，1 200～900 cm与指纹区3个典型分析谱区，并在此基础上应用聚类分析。结果 利用FTIR获得了分别率高、重现性好的红外光谱图，在基线校正和归一化处理后的聚类分析结果，能使所有洁净室采集的环境菌得到归类，并建立本实验室洁净室环境菌库。结论 FTIR法用于药品微生物洁净室环境菌库的建立，具有简单、快速、准确的特点。
[关键词] FTIR；聚类分析；洁净室；环境菌库
[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）01（a）-0125-03
药品无菌检查和微生物限度检查必须在严格控制微生物污染的环境下进行，为了保证药品质量安全，维持药品洁净实验室操作环境的稳定性和检测结果的可靠性，必须对药品洁净实验室进行微生物监测和控制（2015版《中国药典》四部9205），而药品洁净实验室微生物的污染主要来源于操作者和物料。为了排除药品无菌检验过程中假阳性的现象，应定期对药品洁净实验室进行环境微生物的监测和控制并建立洁净室环境菌库，以此来判断检出菌与环境菌的关联性，以排除实验过程的污染。而微生物环境菌库的建立方法不外呼用生化分析和分子生物学（如16SrDNA序列同源性）分析手段，但这些方法都耗时过长，且花费的成本过高，不适于药品微生物快速检验的要求。近年来，傅立叶变换红外光谱技术（FTIR）应用于微生物鉴别的报道越来越多，它能够反映全细胞信息，甚至细胞核中蛋白质，多糖，核酸的分子振动情况，且它的分辨率高，重复性好[1]。该实验室每周定期对洁净室的浮游菌和沉降菌及表面微生物进行采集，应用FTIR技术对采集到的环境菌进行光谱扫描，通过聚类分析法确定其归属，建立本单位微生物洁净室环境菌库。
1 实验材料
TENSOR-27-HTS-XT傅立叶红外微生物测量系统（德国Bruker）；OPUS6.5分析软件（德国Bruker公司）；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；微生物FTIR图谱测量专用的B-module附件，配有DTGS检测器，ZnSe载样窗片（德国Bruker公司）；电动接种环（德国Braun公司）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，青岛高科园海博生物技术有限公司）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，青岛高科园海博生物技术有限公司）。
2 实验方法
2.1 洁净室环境菌的采集
根据2015版《中国药典》四部9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则要求，该实验室采用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）与沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）平皿定期对洁净区不同部位的沉降菌和浮游菌及关键的检测台面、人员操作服表面及5指手套表面的微生物进行采集，采集方法按《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》与《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》现行国家标准进行。表面微生物的采集方法按《中国药典》四部9205要求进行。
2.2 实验用各菌株的培养
将洁净区采集到的环境菌分别置35℃和25℃培养3 d与5 d后，挑取细菌的单个菌落表面中心划线于TSA平板上，于35℃培养24 h，准备FTIR扫描。标准菌株采用同样的培养条件在相同的培养时间下培养，形成单菌落[2]。
2.3 FTIR测定样品菌膜的制备和光谱采集
取上述相同培养条件的各菌种，用电动接种环挑取单个菌落表面中心，置于100 μL超纯水中，制成均匀的菌悬液，随后取15 μL于ZnSe载样窗片上置于鼓风干燥箱中干燥15 min后待形成均一等厚的菌膜，进行FTIR测定。
将ZnSe载片置于B-module样品仓中，进行FTIR测定，实验参数为：波段4 000～600 cm，信号累加64次，光谱分辨率为4 cm，自动平滑处理。
2.4 环境菌FTIR光谱库的建立和分析
应用OPUS6.5提供的定性软件建立谱库，依据Bruker的用户手册提供的方法，采用35℃培养（24±2）h的细菌，按单谱图建立细菌菌库。
对红外光谱首先进行一阶导数和矢量归一化，选取900～1 200，2 800～3 000，1 500～1 800cm 3个典型的谱段进行判别。900～1200 cm为多糖类物质的典型吸收带，2 800～3 000 cm为细胞膜上脂肪酸的特征吸收，而1 500～1 800 cm则是蛋白质酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的吸收。
3 实验结果—环境菌傅里叶红外图谱的建立
每周定期从洁净环境中采集的微生物（约2～4株），共采集12个月，挑选典型菌落，共106株菌进行纯培养，采集FTIR图谱，建立环境菌库。在同样的培养条件下，每株菌制作3张图谱，剔除溢出光谱后取平均光谱，分别将近2个月，近半年以及一年菌株的红外图谱在特定谱段进行聚类分析，结果见图1、图2和图3
将整个一年的环境菌红外图谱进行聚类分析，结果见图4。
从上述图可以看出，全年环境菌红外图谱差异较大，近两个月各菌株红外图谱差异最小。
4 结论
因洁净室的微生物污染主要来源于外环境，在短时间内洁净区的污染微生物可能与外环境不同，但长期来说，洁净室的微生物基本与外环境一致。通过对该单位洁净室环境浮游菌和沉降菌进行的采集，建立一整年的环境菌FTIR菌库，将近2个月的图谱作为近期的环境菌库，并定期进行调整，即不断加入新的菌图谱，剔除最初期的图谱，使该菌库能真实反映洁净实验室微生物污染的动态状况，并为药品检出菌与环境菌相似性分析（药品检出菌是否为环境菌污染）提供简便、快捷的分析方法，为药品无菌检查一次检出提供了准确性保证。
5 讨论
①微生物的红外光谱技术灵敏度非常高，可以鉴别具有相近亲缘关系的微生物，为了保证结果的可靠性，需要在标准化的条件下建立系统化的谱库。培养基、培养温度与培养时间及样品预处理对红外光谱都会产生影响，这些实验条件应符合标准操作规程。
②样品预处理过程中的非同源性、样品量、菌膜的干燥程度以及测量因素都会影响红外光谱图。因此，需要对同一样品进行多次测量，剔除溢出光谱，以确保红外光谱图的重现性。
③即使在标准条件下制备样品，生物样品的光谱仍会表现出一定的变异性。对同一样品进行多次测量，剔除溢出光谱，计算得到的平均光谱来分析未知微生物，可以在相应的阈值内相比，准确性更高。
④药品洁净实验室环境菌库的建立是一个持续动态的过程，需要在日常工作中不断持续的监测才能得以完善。
[参考文献]
[1] 蔡飞，陆峰.傅里叶变换红外光谱结合化学计量学在微生物判别、分类、鉴定中的应用[J].药学实践杂志，2002，20（4）：239-240.
[2] 裴琳，胡昌勤，马仕洪，等.FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相关性考察[J].药学学报，2007， 42（11）：1189-1194.
（收稿日期：2017-10-15）