摘要 目的：通过蔡氏扶正消症汤生药对胃癌血管内皮生长因子表达的影响，探究蔡氏扶正消症汤抑制胃癌血管生成的机制研究。方法：用免疫组化S-P法检测对肿瘤血管内皮细胞生成因子(VEGF)表达的影响。结果：蔡氏扶正消症汤浓度为1.1mg／ml时其平均吸光度分别为0.096±0.004，与空白对照组平均吸光度0.125±0.025相比，有非常显著性差异(P＜0.01)，并且VEGF平均吸光度随蔡氏扶正消症汤的浓度增加而降低。结论：蔡氏扶正消症汤能抑制VEGF的表达。
关键词 蔡氏扶正消症汤 胃癌 血管内皮细胞生长因子 实验研究
肿瘤血管是肿瘤生长、转移的重要因素之一，肿瘤血管不仅为肿瘤本身提供充足的营养，而且可以提供肿瘤向远处播散，导致肿瘤的恶性生长和复发、转移。近几年来，针对肿瘤复发转移的研究焦点逐渐集中在肿瘤血管生成方面，抑制肿瘤血管生成成为临床急于解决的问题。蔡氏扶正消症汤是全国老中医药专家学术经验继承指导老师蔡慎初教授数十年临床治疗肿瘤的经验方，它能够提高患者的生活质量，延长患者的生存期。为探究其抗癌机制，我们通过体外实验，观察该方对胃癌血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响，研究药物抑制胃癌生长、转移、复发的机制。
1 材料
1.1 细胞株和细胞培养：胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海生化和细胞生物研究所。将SGC-7901细胞接种于10％胎牛血清、100U／ml青霉素和100U／ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3d换液一次，长满后常规胰蛋白酶消化法传代培养［1］。
1.2 药物及其制备：蔡氏扶正消症汤主要由黄芪、人参、莪术、藤梨根、露蜂房、八月札、白毛藤、徐长卿、全蝎等中药组成。经三蒸水漂洗3次，于烧杯中煎煮30分钟去渣，8层纱布过滤，60~80℃隔水蒸，浓缩成生药1.1g／ml，调pH值7.0~7.2，4℃保存备用。用前再经3000 rpm×5 min离心去渣。
1.3 主要试剂：RPMI-1640购自美国GIBCO公司；胎牛血清为天津市正江高科技有限公司产品；青霉素为石家庄制药集团有限公司产品；链霉素为华北制药股份有限公司产品；3-(4，5二甲基噻唑)-2，5一二苯基氮唑溴盐(MTT)购自华美生物工程公司；二甲亚砜为江苏鸿声化工厂生产的分析纯试剂；胰蛋白酶使用sigma公司产品；VEGF和VEGF免疫组化试剂盒为迈新生物技术开发公司生产。
1.4 主要仪器设备：倒置相差显微镜；德国Leica；酶标仪Elx800美国；光学显微镜(0lympus)：纯水仪(Millipore)；二氧化碳培养箱(Cellstar)；烤箱(Heraeus)；显微摄像系统(01ympus)。
2 实验方法
免疫组化S-P法［2］检测对VEGF表达的影响。
2.1 细胞爬片的制备：在六孔板中放入盖玻片，SGC-7901细胞以8×105数接种于六孔板中培养，待细胞在盖玻片铺满约50％时分别加入0、1.1、2.2、3.3、4.4、5.5mg／ml 蔡氏扶正消症汤给予处理，24h后取出盖玻片，80％乙醇室温下固定5min，PBS清洗3次×5min。
2.2 实验步骤：按试剂盒要求进行。①每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min；PBS冲洗3×3’。②甩去PBS液，每张切片加1滴或50μl的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10min；甩去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，阴性对照组加PBS，室温下孵育60min或4℃过夜；PBS冲洗3×5’。③甩去PBS液，每张切片加1滴或50μl的生物素标记的第二抗体(试剂C)室温下孵育10min；PBS冲洗3×3’。④甩去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10min；PBS冲洗3×3’。⑤甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察10min，阳性显色为棕色或红色；自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝；玻片经过梯度酒精脱水干燥(二甲苯透明)，中性树胶封固。
2.3 统计学处理：不同药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析，各药物浓度组与对照组的比较采用t检验，以a=0.05为检验水准，采用SPSS12.00数据分析系统。
3 结果
蔡氏扶正消症汤对血管内皮细胞生长因子(VEGF)平均吸光度的影响：免疫组化VEGF阳性细胞为胞浆棕褐色；平均吸光度测量软件分析结果如表1所示，空白对照组平均吸光度分别0.125±0.025，而蔡氏扶正消症汤浓度为2.2mg／ml时平均吸光度为0.080±0.01(P＜0.05)，4.4mg/ml时为0.053±0.007和5.5mg／ml时为0.043±0.001(P＜0.01)，与对照组比较有显著性差异，VEGF平均吸光度随蔡氏扶正消症汤浓度增加而降低，说明蔡氏扶正消症汤能抑制VEGF的表达。
4 讨论
蔡氏扶正消症汤是根据胃癌的虚、瘀、毒的病因病机而遣方用药，认为虚、瘀、毒贯穿于胃癌病程始末。“虚”是指人体正气相对不足；“毒”既是外侵之毒邪的作用的结果，又是存在于体内的有毒之邪，耗伤人体之气血，使人体正虚而邪实；至于“瘀”，因胃癌多与情志失调有关，肝郁气滞，日久血行不畅，挟毒邪积于胃部而成癌，该方中含有益气扶正药人参、黄芪相配伍，不仅在抗肿瘤免疫方面具有独特的疗效，还可以提高机体的非特异性免疫功能和特异性免疫功能，很好地改善肿瘤患者免疫功能低下的状态，从而抑制肿瘤的生长作用［3-4］破血祛瘀、行气散结的莪术、八月札、徐长卿，现代药物研究莪术对癌细胞有快而强的直接破坏作用，并能增强瘤细胞的免疫原性，促进机体对肿瘤的免疫排斥反应；另外还有清热解毒、消坚散结的白毛藤、藤梨根，攻毒散结的露蜂房、全蝎等，全方共起到扶正消症之效［5-9］。
胃癌的生长、浸润和转移需要大量的新生血管，且血管生成的增效强度和肿瘤转移能力呈正相关。肿瘤在生长过程中可分泌浸蚀血管并促进新生血管形式的物质。VEGF是一种特异性作用于内皮细胞的多功能因子，对诱导和调节肿瘤血管形成有重要作用。VEGF能增加血管尤其是微血管的通透性［10］。为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络。VEGF是一种选择性促血管内皮细胞有丝分裂原［11］，直接刺激内皮细胞增殖，并产生纤维蛋白原激活剂和胶原酶。这不仅可促进内皮细胞活动，有利于血管生成，而且还有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近组织扩散，为肿瘤的浸润转移创造条件。VEGF已作为一种反映肿瘤血管生成，判断肿瘤生物异质性的预后指标。
本实验应用免疫组化S-P法，检测蔡氏扶正消症汤对VEGF的表达情况。结果显示：VEGF平均吸光度随着蔡氏扶正消症汤浓度增加而降低，说明蔡氏扶正消症汤能抑制VEGF的表达，最终可能抑制肿瘤的血管生成作用。
5 参考文献
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收稿日期 2006-12-08