张晓利 苏君
摘要：目的 探讨小归芍化浊解毒方对实验性胃癌前病变的作用和机制。方法 按随机数字表把100只大鼠随机分成为A组（空白组）、B组（模型组）、C组（中药大剂量组）、D组（中药小剂量组）、E组（对照组），每组20只。除空白组外，其余各组采用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）配合饥饱失常诱导造模。造模后A组正常喂养，B组予蒸馏水灌胃，C组按2 mL/kg予小归芍化浊解毒方大剂量混悬液灌胃，D组按2 mL/kg予小归芍化浊解毒方小剂量混悬液灌胃，E组予胃复春混悬液灌胃。观察大鼠胃黏膜的组织病理变化，测定胃组织表皮生长因子受体（EGFR）及血管内皮生长因子（VEGF）表达。结果 与胃复春组比较，小归芍化浊解毒方大剂量组能有效改善胃黏膜肠化和异型增生（P<0.05），小归芍化浊解毒方大、小剂量组能明显降低VEGF的表达水平（P<0.05），小归芍化浊解毒方大剂量组能明显降低EGFR的表达水平（P<0.05）。结论 小归芍化浊解毒方可能通过降低VEGF及EGFR的表达，逆转胃癌前病变。
关键词：小归芍化浊解毒方；胃癌前病变；表皮生长因子受体；血管内皮生长因子；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.12.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）12-0034-03
Effect of Eliminate Turbid Fluid and Remove Toxicity of Xiaoguishao on EGFR and VEGF in Rats with Gastric Carcinoma Precancerosis WANG Zhi-kun1， LIU Qi-quan1， LI Bo-lin2， DONG Lin-lin2， WU Yun-chu2， ZHANG Xiao-li1， SU Jun3 （1.TCM Hospital of Heibei Province， Shijiazhuang 050011， China；2.Hebei Medical University， Shijiazhuang 050011， China；3.Renmin Hospital of Guangping， Guangping 057650， China）
Abstract：Objective To explore the mechanism of eliminate turbid fluid and remove toxicity of Xiaoguishao on experimental gastric carcinoma precancerosis. Methods According to the random number table， 100 normal rats were divided into group A （blank control）， group B （model）， group C （TCM with large dosage）， group D （TCM with small dosage）， group E （control）， with 20 rats in each group. By using N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine and method of irregular diet， all rats but blank control group were induced to gastric carcinoma precancerosis models. After creation of models， group A were feed normally， group B， C， D and E were intragastrically administrated with distilled water， suspension of eliminate turbid fluid and remove toxicity of Xiaoguishao with large dosage 2 mL/kg， suspension of eliminate turbid fluid and remove toxicity of Xiaoguishao with small dosage 2 mL/kg， suspension of Weifuchun respectively. Then histopathology of gastric tissues was observed. Meanwhile， the levels of EGFR and VEGF in gastric tissues were tested. Results Compared with group E， the histopathology in gastric tissues of group C were significantly ameliorated （P<0.05）， VEGF of group C and D were significantly reduced （P<0.05）， EGFR of group C was significantly reduced （P<0.05）. Conclusion By means of reducing the levels of VEGF and EGFR， reversal effect of eliminate turbid fluid and remove toxicity of Xiaoguishao on gastric carcinoma precancerosis was produced.
Key words：eliminate turbid fluid and remove toxicity of Xiaoguishao； gastric carcinoma precancerosis；EGFR；VRGF；rats
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是以胃黏膜固有腺体萎缩为主要表现的慢性炎症。在CAG基础上伴发的肠上皮化生和异型增生被认为是胃癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC），其与胃癌的发生有密切关
基金项目：河北省中医药管理局科研课题（2009014）
通讯作者：李博林，E-mail：libolin0313@163.com
系。因此，逆转PLGC越来越受到关注。本实验旨在通过观察小归芍化浊解毒方对PLGC大鼠表皮生长因子受体（EGFR）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，进一步探讨该方治疗PLGC的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
8周龄清洁级雄性Wistar大鼠100只，体质量120～140 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物学部，许可证号：SCXR（鄂）2004-0007。
1.2 药物与试剂
冬凌草10 g，藤梨根15 g，紫豆蔻6 g，黄连6 g，半夏6 g，瓜蒌15 g，当归12 g，白芍15 g，川芎9 g，茯苓15 g，白术10 g，泽泻6 g。所需药物均购自四川新绿色药业科技发展股份有限公司研发的免煎制剂。上述药物用蒸馏水溶解稀释配制成大剂量（15 g/mL）、小剂量（10 g/mL）的中药混悬液备用。胃复春片由杭州胡庆余堂有限公司生产，批号1008162。VEGF试剂盒，北京华英生物技术有限公司提供；单克隆抗体，Santa Cruz公司提供；EGFR试剂盒单克隆抗体，美国Santa Cruz公司生产，中山试剂公司分装。
1.3 主要仪器
AO切片机，德国LEICA公司产品；QC-191型自动放免分析仪，中国科技大学实业总公司生产；RS-28高速低温离心机，德国贺利氏公司生产；ACS-EAS电子天平，北京菲姆斯特科技开发公司生产；光学显微镜，日本Olympus公司生产；PYX- DHS-35S型隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂产品。
2 实验方法
2.1 分组
将100只大鼠按随机数字表法分为A组（空白组）、B组（模型组）、C组（中药大剂量组）、D组（中药小剂量组）、E组（对照组），每组20只。
2.2 造模
除空白组外，其余各组采用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）配合饥饱失常诱导造模。①自由饮用MNNG溶液法：将MNNG用蒸馏水配成1 g/L的保存液，避光4 ℃保存，每日配置100 µg/mL稀释液置棕色瓶中，动物自由饮用。②饥饱失常法：2 d足量喂食，1 d停食，循环实施。并于第1、3、5、7周用无水乙醇2 mL灌胃各1次。共24周。在造模期间，A组未见死亡，B组死亡3只，C组死亡2只，D组死亡2只，E组死亡1只。
2.3 给药
A组正常喂养；B组予蒸馏水2 mL/d灌胃；C组按2 mL/kg予小归芍化浊解毒方大剂量混悬液灌胃；D组按2 mL/kg予小归芍化浊解毒方小剂量混悬液灌胃；E组将胃复春以0.5%CMC-Na水溶液配制成适当浓度的混悬液后，按1.4 g/（kg·d）灌胃。各组每日14时由研究人员灌胃1次。连续24周。
2.4 标本采集与处理
末次给药后，禁食不禁水24 h，给予2%戊巴比妥钠40 mg/kg行腹腔内麻醉。处死大鼠，剖胃，沿大弯纵行剪开胃，每只大鼠在胃窦部取材。放置10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，一部分常规HE染色，另一部分免疫组化监测。
2.5 观测指标与检测方法
2.5.1 胃黏膜大体观 将大鼠胃取材后，平铺观察台上，观察胃黏膜的色泽、胃壁厚度、弹性、出血点或淤斑、皱襞、黏液及黏膜增生结节等情况。
2.5.2 胃黏膜组织病理观察 参照2006年“中国慢性胃炎共识意见”[1]进行诊断及分类，并分等级如下：非肠化及异型增生（-），肠化（+），轻度异型增生（++），重度异型增生（+++）。
2.5.3 胃黏膜表皮生长因子受体及血管内皮生长因子表达 采用免疫组化法分析胃窦组织中EGFR、VEGF表达，按试剂盒说明书步骤操作；其阳性表达判定采用显微摄像计算机图像分析系统，每张切片随机检测5个视野（×400）。以检测的平均光度值作为判别标准。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量数据采用—x±s表示，采用t检验；等级资料采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 胃黏膜一般情况
正常组大鼠胃黏膜呈浅红色，全层胃壁较厚，手感弹性较好，皱襞规整，被覆较多黏液。模型组胃黏膜颜色多呈苍白或灰白色，黏膜层变薄，胃壁弹性减弱，皱襞走向紊乱或平坦，部分外观有出血点及颗粒样结节， 黏膜下可透见树枝样血管。小归芍大剂量组黏膜接近正常组，小剂量组及对照组均有不同程度的充血，黏膜呈淡红或黯红，皱襞较深，少许黏液附着。
4.2 胃黏膜病理变化（见表1）
表1 各组大鼠胃黏膜病理分级比较
组别只数病理分级阳性率（%）
-++++++
A组20200000
B组17 1376 94
C组1810521 44*#
D组18 7542 61*
E组19 5473 74*
注：与B组比较，*P<0.05；与E组比较，#P<0.05（下同）
4.3 小归芍化浊解毒方对胃癌前病变大鼠胃黏膜血管内皮生长因子与表皮生长因子受体表达的影响（见表2）
表2 各组大鼠胃黏膜VEGF与EGFR表达水平比较（—x±s，%）
组别nVEGFEGFR
A组50.390±0.019160.01± 41.05
B组50.814±0.028689.88±111.39
C组50.433±0.015*△169.81± 31.71*△
D组50.599±0.031*#197.47± 29.93*
E组50.682±0.021*191.61± 33.00*
注：与D组比较，△P<0.05
5 讨论
胃癌前病变是一个病理学概念，一般指中、重度异型增生和不完全性结肠性化生[2]。中医学无此病名，因其临床多表现为胃脘隐隐灼痛、痞塞胀满、嗳气、纳呆等症状，故多数学者将PLGC归属中医学“胃痞”、“胃脘痛”、“嗳气”等范畴。本病属本虚标实之证，在本则是脾胃气阴两虚，在标则为湿阻、血瘀、热毒[3]。本病的病机为气机郁滞、湿热内阻、热毒蕴结、瘀血停滞、阴液亏虚，病机之间相互转化夹杂，其中湿浊和热毒是本病的发病及病机演变关键所在。毒为热之极，热为毒之渐，加之脾胃气阴不足，脾失健运，胃腐熟水谷功能失司，则水反为湿，谷反为滞，久则化浊成毒[4]。浊毒相关为害贯穿于PLGC始终。浊毒黏滞致使胃络瘀滞，气不布津，血不养经，胃失荣养，腺体萎缩久久不愈，终则发生肠上皮化生或异型增生[5]。故笔者临床选用当归芍药散合小陷胸汤合方制成的小归芍化浊解毒方治疗该病。方中重用瓜蒌清热解郁，紫豆蔻化浊消痞行气；冬凌草、藤梨根、黄连清热解毒；半夏降逆消痞，与黄连相伍，辛开苦降，消痞散结；茯苓、白术益气健脾利湿；泽泻配茯苓白术既可利水渗湿，又有泄热之功；白芍养阴，《本草备要》记载其“补血，泻肝，益脾，敛肝阴，治血虚之腹痛”；当归、川芎调肝和血、活血化瘀。诸药合用，使浊邪祛、毒邪解，从而逆转腺体萎缩、肠上皮化生和异型增生。
在从癌前病变到胃癌的演变过程中，通过合成、释放或引起宿主相应的反应而产生各种可检测的分子生物学指标，对临床有重要的价值[6]。研究表明，在生理状态下，EGFR的激活对细胞的生长、分化具有调节作用，但是它的过度表达与细胞的增殖和癌变密切相关。EGFR在胃各级病变中的动态变化提示其参与胃癌的发生、发展并且与肿瘤转移有关，对预后的判断有一定的意义[7]。VEGF是目前已知最为有效的内皮特异性促有丝分裂原，能特异地作用于内皮细胞诱导和调节肿瘤血管形成；VEGF还具有增强血管通透性的作用，促进液体、纤维蛋白原外渗，形成血管外纤维蛋白基质，为细胞在血管形成过程中迁移提供纤维网架，使异型增生的细胞得以逃脱免疫监视；此外，其主要作用于胃血管内皮细胞，能促进胃黏膜血管内皮细胞增殖，又能促使血管渗漏，同时还可特异性诱导胃淋巴管的生成。这些均对胃肿瘤在血管形成期起到直接的促进作用。本实验表明，小归芍化浊解毒方可能通过降低EGFR、VEGF的表达，阻断并逆转PLGC，起治疗胃癌前病变的作用。
参考文献：
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[6] 许钟，毛振彪.胃癌癌前病变相关分子研究若干进展[J].国际消化病杂志，2008，28（31）：183-185.
[7] 兰春慧，张小雨，吴小翎，等.胃癌及癌前病变中表皮生长因子受体和P21ras蛋白表达的研究[J].中国现代医学杂志，2000，10（7）：17-18.
（收稿日期：2012-02-16，编辑：华强）